川芎嗪对高糖环境大鼠肾小球系膜细胞增殖及其细胞外基质含量的影

【摘要】 目的:探讨川芎嗪对高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞（MCs）增殖及其细胞外基质含量的影响。方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞株，分对照组、高糖组、TMP组，分别培养12 h、24 h、48 h，CASY细胞计数仪计数细胞存活率；以CCK—8法检测细胞增殖；以ELISA法检测细胞上清液细胞外基质Col IV及FN的含量。结果:各TMP浓度组之间存活率无统计学差异（P0.05）；与对照组比较，高糖下培养24 h、48 h MCs增殖显著增快（P0.01），分泌的Col IV及FN含量增多（P0.05）；与高糖组比较，TMP各组MCs增殖显著减慢（P0.01），分泌Col IV及FN减少（P0.01或P0.05）。结论:川芎嗪可以有效抑制高糖的促增殖作用并能减少系膜细胞外基质的增加。

【关键词】 糖尿病肾病 川芎嗪 细胞增殖 细胞外基质 大鼠。

Abstract: Objective: To explore the effects of tetramethylpyrazine on proliferation of mesangial cells and the concentration of extracellular matrix in high glucose cultured rat mesangial cells. Methods: Rat mesangial cells were divided into control group， high glucose group and TMP group, and were cultured for 12 h, 24 h and 48 h. At indicated time points, cellular survival rate and proliferation were identified with cell counting instrument and CCK—8, The supernatants were collected and the Collagen type IV and Fibronectin were detected with enzyme—linked immunosorbent assay. Results: The survival rates of different groups were not involved (P0.05). Compared with control group, the cellular proliferation and the concentration of Collagen type IV and Fibronectin increased in high glucose group at 24 h and 48 h (P0.05). Compared with that in high glucose group, the cellular proliferation and the concentration of Collagen type IV and Fibronectin declined in different concentration TMP groups (P0.01,P0.05). Conclusion: Tetramethylpyrazine can significantly inhibit proliferation and secretion of Collagen type IV and Fibronectin in high glucose induced rat mesangial cells.

Key words: diabetic nephropathy; tetramethylpyrazine; cellular proliferation; extracellular matrix; rat extracellular matrix。

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）的主要病理改变是系膜细胞增殖及纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）、Ⅳ型胶原(Collagen type IV，Col IV)等细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分增多。川芎嗪又名四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)，是从伞形科藁本属植物川芎根茎中提取分离的生物碱单体，具有改善微循环、血液流变学，降血糖、抗氧化、抗纤维化和拮抗钙离子等药理作用，已广泛应用于心、脑、肺、肾及血管疾病的治疗，大量临床及动物实验证明TMP对DN有很好的疗效。本研究观察了TMP对高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞（rat mesangial cells，MCs）增殖及FN、Col IV含量的影响，进一步探讨TMP对糖尿病肾病的保护作用及其可能机制。

1 材料和方法。

1.1 材料 大鼠肾小球系膜细胞株购自上海长征医院；盐酸川芎嗪粉剂购自山东长富洁晶药业有限公司；正常葡萄糖（含5.5 mmol/L D—葡萄糖）及高糖（含25 mmol/L D—葡萄糖）DMEM培养液购自美国Gibco公司；胎牛血清（FCS）购自天津正江高科技有限公司；CCK—8试剂购自上海同仁化学研究所；FN及IV型胶原ELISA试剂盒购自美国ADL公司；酶标仪(BIO—TEK FL—800美国产品)；细胞分析仪/CASY细胞计数仪（德国CASY公司产品）。

1.2 方法。

1.2.1 以CCK—8法检测细胞增殖活力：取对数生长期MCs细胞，以2000个/孔铺于96孔板，待MCs细胞贴壁后，吸去原有DMEM培养液，换为1% FCS培养液,培养24 h使所有细胞的生长同步化。随机分5组:①对照组（5.5 mmol/L D—Glu DMEM培养液）。②高糖组（25 mmol/L D—Glu DMEM培养液）。③TMP低剂量组（高糖培养液+200μg/ml TMP）。④TMP中剂量组（高糖培养液+500μg/ml TMP）。⑤TMP高剂量组（高糖培养液+1000μg/ml TMP）。每组设6个复孔，分别作用12 h、24 h、48 h，于每个时间点结束前1 h加入10μl/孔CCK—8，37 ℃、5% CO2条件下继续培养1 h后检测OD450。

1.2.2 检测细胞存活率：按上述培养、分组和作用方法，用9.9 ml缓冲液，0.1 ml细胞悬液于CASY细胞计数/分析仪器上直接检测细胞存活率。

1.2.3 检测细胞上清中Col Ⅳ和FN含量：双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞上清中Col Ⅳ和FN含量,按试剂盒说明书操作。每项指标每组设6孔，根据标准品的标准曲线求出相应的含量，为排除细胞数目对上清中Col Ⅳ和FN含量的影响，对每孔细胞数目进行校正，按每孔细胞数为1×106个来校正所得数据。