腹腔镜检查结合RTPCR在胃癌诊疗中的临床意义

【摘要】 目的：探讨进展期胃癌术前腹腔镜检查与RTPCR检测腹腔灌洗液中游离癌细胞CEAmRNA的表达水平，在胃癌患者术后微转移及预后的临床意义。方法：对22例进展期胃癌患者术前行腹腔镜探查，灭菌生理盐水冲洗腹腔4～5次，收集脱落细胞，进行细胞学检查和RTPCR检测CEAmRNA表达水平。结果：22例胃癌患者中，细胞形态学检测31.8%（7/22）阳性，RTPCR检测54.5% (12/22)CEAmRNA阳性表达，二者阳性率有显著性差异(P＜0.05)。结论：诊断性腹腔镜检查、RTPCR与PLC有效结合，可提高腹腔转移复发诊断的灵敏性和特异性，有助于对胃癌分期、淋巴转移和预后的综合判断，对胃癌的辅助治疗提供依据。

【关键词】 腹腔镜检查 胃肿瘤 游离癌细胞 RTPCR。

The clinical significance of laparoscopy combined with RTPCR in gastric carcinoma diagnosis and therapy 　　【Abstract】 Objective:To explore the clinical value of preoperative laparoscopy of progressive gastric cancer combined with RTPCR monitoring of CEA mRNA expression of peritoneal lavage fluid(PLF) in micrometastasis and prognosis of postoperative patients with gastric cancer.Methods：Before operation,we examinated 22 patients with progressive gastric cancer by laparoscopy,washing abdominal cavity with 0.9%NS about 4 to 5 times,and collected peritoneal free cells detected by cytology and RTPCR analysis.Results:The overall positive rate of cytology was 31.8%（7/22),RTPCR positive rate was 54.5% (12/22),which was significantly higher than cytology findings(P＜0.05).Conclusions:The efficient association of diagnostic laparoscopy,RTPCR and PLC(peritoneal lavage cytology) can improve diagnostic specialty and sensitivity of peritoneal metastasis.It is conducive to comprehensive evaluation of gastric cancer staging,lymphnode metastasis and prognosis,which will provide evidence for adjuvant therapy of gastric cancer. 　　【Key words】 Diagnostic laparoscopy;Gastric carcinoma;Free cancer cells;RTPCR。

胃癌在我国的患病率和死亡率均居恶性肿瘤前列，手术是最有效的治疗方法，但半数以上的患者术后复发转移，从而导致手术失败。腹腔游离癌细胞(free cancer cells，FCC)在腹腔内形成肉眼或HE染色均不能发现的微转移灶是胃癌复发的重要原因。Nakanishi等［1］提出侵及浆膜层的肿瘤细胞易于脱落的原因与肿瘤细胞缺乏CD44和βintergin粘附分子表达有关，IFCCs在腹腔细胞刺激因子作用下，生物活性增高，侵及腹膜下组织形成微小转移灶，致术后转移扩散。本研究首次运用腹腔镜的微创伤性、RTPCR的特异性和灵敏性检测腹腔灌洗液(peritoneal lavage fluid,PLF)中游离癌细胞及其CEAmRNA表达水平，明确胃癌腹腔转移的形成机制，为胃癌的临床诊疗提供依据。

1 资料与方法。

1.1 试剂与设备 RTPCR试剂、琼脂糖、DNA Marker、DEPC水、Taq酶购自上海生工；CEA(p1 5‘gagcgaacctcaacctctcctgccact3‘;p2 5‘tgtagctgttgcaaatgctttaaggaagaagc3‘,367bp)引物由上海博亚合成；TRIzol试剂购自Invitrogin公司；腹腔镜、离心机、5700PCR扩增仪、超低温冰箱、电泳仪、凝胶成像系统。

1.2 手术方法。

1.2.1 细胞的收集 自2005年3月至2007年6月收集我院对22例进展期胃癌患者行腹腔镜探查的临床资料，男12例，平均(56.5±6.2)岁，女10例，平均(60±5.6)岁，用腹腔镜技术进行腹腔灌洗，用42℃、300ml灭菌生理盐水冲洗胃床、腹腔，吸尽冲洗液，加入EDTA抗凝剂，3 000转/min离心10min，弃上清，部分脱落细胞固定HE染色，由两位细胞学医师盲法随机阅片，做出诊断。另部分沉淀脱落细胞迅速置于超低温冰箱用于mRNA提取。

1.2.2 总RNA提取 Trizol体系提取总RNA。提取的RNA用0.1%DEPC水溶解，紫外分光光度仪检测RNA样品的OD260nm/OD280nm比值，得到RNA浓度，然后置于—80℃保存或立即检测。

1.2.3 RTPCR 1μg总RNA、1μl MMLV、7μl逆转录反应体系、1μl antisense primer P1、去Rnase水补至20μl，快速离心混匀，37℃1h,95℃10min灭活MMLV，快速离心使沉于底部。PCR反应 19μl PCR反应体系、1μl Sense primer p2、58μl超净水, 快速离心混匀，95℃ 5min,快速离心，使沉于管底，加入2μl(1μ/μl)TaqDNA聚合酶，快速离心均匀，加入100μl液体石蜡。循环条件:94℃ 1min、58℃ 1min、72℃ 1min，循环35次，末次延长7min。PCR 扩增产物2%琼脂糖(含EB0.5mg/L)DNA电泳。

2 结果 　　22例进展期胃癌患者中，经腹腔镜PLC HE染色细胞形态学检测游离癌细胞31.8%（7/22）阳性；RTPCR检测54.5% (12/22)CEAmRNA阳性表达。χ2检验两者检测阳性率存在显著性差异(P0.05)。

3 讨论 　　PLC检查是一个有用的预测预后的因素，由于该法是检测PLF中FCCs，故敏感性较差。应用PLC检测胃癌FCCs的阳性率各家报道不一，诊断腹腔转移的特异性也存在差别。Abe等［2］在77个常规PLC检查阴性的胃癌中，14个（22%）出现腹腔复发，在17个常规PLC检查阳性胃癌中，只有3个（18%）出现腹腔复发，故认为常规PLC检查并不是一个预测腹腔复发的敏感指标，其估计预后的价值也是有限的。Tokuda等［3］应用常规PLC在136例胃癌患者中FCCs阳性率仅为3.6%。 　　PLC或PLC结合PLF中肿瘤标志物是预测胃癌腹腔复发的有效指标，但是，对PLF中仅有的少量FCCs就需采用新的方法加以确认，因为上述实验结果阴性的患者仍有部分出现腹腔转移复发。Yonemura等［4］应用RTPCR技术测定了PLF中MMP7（matrix metalloproteinase7）mRNA表达，结果检测到样品中10个以下癌细胞，而在间皮细胞、成纤维细胞、外周血和胃良性病变患者腹腔灌洗液中均未检测到MMP7mRNA信号。该法预测腹腔肿瘤播散的敏感性为33%，结合PLC检查可达62%。本组实验经腹腔镜PLC HE染色细胞形态学检测游离癌细胞32.6%阳性；RTPCR检测55.8% CEAmRNA阳性表达,与国外报道［4］基本一致。 　　Fujii等［５］应用RTPCR和PLC检查了86例胃癌PLF中FCCs，结果13个肉眼可见腹腔转移的患者CEAmRNA均阳性，而24个无浆膜浸润的患者CEA均阴性。在49个肉眼可见浆膜浸润但无腹腔转移的患者中，常规PLC阳性率仅为12%，而RTPCR CEAmRNA阳性率达55%，在CEA阳性患者中，术后12个月内腹腔复发转移率为56%， Yonemura等［４］对230个胃癌PLF中CEAmRNA的研究结果表明，PLF中RTPCR CEAmRNA、PLC和ELISA法测定的CEA水平的阳性率分别为17%、19%和15%。PLC与淋巴结状态、浸润深度和静脉浸润有关，RTPCR CEA仅与腹腔复发相关，而PLF中CEA水平与腹腔复发无相关性。CEA RTPCR预测腹腔复发的敏感性和特异性分别为31%和95%，准确性达73%。结合PLC检查诊断腹腔复发的敏感性可达57%。