转OsEBP—89基因水稻芽期与幼苗期的抗盐性的发展策略
盐害是世界上最严重的环境问题之一。
全球20%的耕地和近半数的灌溉土地都受到不同程度的盐害威胁。
水稻属于不抗盐植物， 土壤的盐害影响使其产量难以提高[1—3]。
提高水稻抗盐能力的方法主要是培育抗盐品种， 而基因工程技术是快速实现这一目的的有力工具[4—6]。
OsEBP—89基因是水稻中一个EREBP（Ethylene responsive elements binding protein）类转录因子[7—8]。
AP2/EERBP转录因子在花发育和逆境胁迫应答过程中起重要作用。
根据该家族基因所含的AP2/EREBP结构域的数目不同可将其分为两类：AP2和EREBP亚家族[9]。
AP2亚家族含有两个正向重复的AP2结构域，主要调控细胞的生长发育；EREBP 亚族含有一个AP2—DNA结合域，主要调节植物对激素、病原、逆境等的响应。
许多外界条件，如乙烯、盐、伤害、低温和干旱等能诱导EREBP亚类家族基因的表达，使植物抗性和耐性提高[9—10]。
已有的研究表明OsEBP—89基因参与了乙烯调控的水稻胁迫反应和种子成熟过程，该基因的表达受激素及其类似物ACC、2，4—D、ABA、BR、JA、GA 和6—BA 的诱导，此外也受盐胁迫的诱导[8，11—12]。
用 NaCl 处理，OsEBP—89基因的表达在处理2 h 后有所升高，此后稍有变化[11]。
但是关于转OsEBP—89基因水稻幼苗抗盐性研究还没有报道。
本试验通过对转OsEBP—89基因水稻T6代种子进行盐胁迫下的发芽试验，研究其芽期及幼苗期的抗盐能力，为进一步研究OsEBP—89基因与水稻抗逆的关系提供依据。
1 材料和方法 1.1 试验材料 本试验用了3个转OsEBP—89基因水稻株系3448，3463和3464及其受体亲本日本晴。
1.2 试验方法 1.2.1 转育水稻纯系的分子鉴定 从同一个转基因株系来源的不同个体后代中各选择16个单株，按CTAB法提取叶片总DNA。
对转基因株系鉴定的PCR扩增的5和3端引物分别为与OsEBP—89基因片段编码区和Ubi启动子区互补，分别为BP89（5—GGGGACGACACACATGACAC—3）和 Ubi—F3（5—CTGATG CATATACATGATGG—3）。
PCR产物大小为520 bp，反应条件为：95 ℃，5 min； 95 ℃，35 s；55 ℃，35 s；72 ℃，35 s；循环35 次；72 ℃，8 min。
在1%的琼脂糖凝胶上电泳，通过紫外照射仪观察结果。
1.2.2 种子萌发试验 每份材料挑选50 粒饱满的种子， 置于垫有滤纸的口径为9 cm 的培养皿中。
先用3%的次氯酸钠溶液处理， 消毒20 min， 然后用自来水冲洗6次。
NaCl（分析纯）胁迫浓度设0（ 蒸馏水） ，100 mmol两个水平。
发芽期和幼苗期调查性状包括发芽势、发芽率、根数、根长和苗高。
在培养皿里分别加入上述2个处理溶液10 mL，加盖后放入28 ℃ 恒温光照箱中催芽。
盐胁迫处理后的第3 天和第7天，以水稻种子的芽长和根长等于2 mm为发芽标准[13] ， 分别调查种子的发芽粒数， 并计算发芽势和发芽率及其相对盐害率。
然后， 将装有发芽水稻种子的培养皿放置于温度为28 ℃ 的恒温的光照箱环境， 再继续生长3 d后每个处理随机选取10 株， 测量其根数、根长和苗高，并计算相应的相对盐害率。
在恒温箱内催芽和幼苗生长期间， 每天定时更换一次盐液。
试验重复3 次。
以相对盐害率的大小来评价水稻发芽期和幼苗期耐盐性的强弱，相对盐害率的计算方法如下。
1.3 数据处理 试验所得数据使用Microsoft Excel 2007及spss17.0 软件进行统计计算。
2 结果与分析 2.1 转OsEBP—89基因纯合株系的分子检测 为检测转基因株系是否为纯系，从每一个转基因株系来源的后代中各选择16个单株，按CTAB法提取叶片总DNA，然后分别利用PCR检测目的基因。
图1 所示为3463株系中16个单株的PCR扩增结果，均能特异性扩增出520 bp的目的片段，说明该株系为含有OsEBP—89基因的纯合株系。
3448和3464株系也有同样的PCR扩增结果，证明3448和3464株系也为转OsEBP—89基因的纯合株系。
2.2 转基因水稻及对照的发芽势和发芽率 在100 mmol NaCl处理条件下转基因株系及对照的芽期发芽势和发芽率见表1，对发芽势来说转基因株系之间存在明显的差异，两个转基因株系3463和3448的发芽势分别为78.5%和70.4%，明显高于对照（3447）的41.5%。
而另一个转基因株系（3464）与对照的发芽势之间没有明显的差异。
2.3 转基因水稻及其对照幼苗期性状表现 为进一步研究OsEBP—89基因的表达对水稻幼苗生长的影响，测定了幼苗前期的相关性状并进行了比较，结果见表2。
在100 mmol NaCl浓度条件下，转基因株系及对照的根长与苗高之间不存在显著差异，但对照日本晴的根数明显多于转基因水稻。
2.4 转基因水稻及对照的芽期及幼苗期综合相对盐害率的比较 对转基因株系及其对照芽期及幼苗期综合相对盐害率进行比较，结果见表3。
3448株系和3463株系的芽期综合相对盐害率分别为35.9%和34.9%，低于对照的52.0%，这说明在100 mmol NaCl 胁迫条件下，芽期转基因株系的耐盐能力高于对照。
3 结论与讨论 本研究在100 mmol NaCl浓度胁迫条件下进行转OsEBP—89基因株系及对照材料的发芽试验，测定不同材料的发芽势、发芽率、根数、根长及苗高，并计算其芽期与幼苗前期综合相对盐害率。
结论如下。
（1）芽期转OsEBP—89基因株系之间抗盐性存在差异，其中两个转基因株系（3448和3463）发芽势比对照日本晴高，芽期综合相对盐害率显著低于对照日本晴，说明OsEBP—89基因的表达可能与转基因株系的芽期抗盐性有关。
（2）幼苗期转OsEBP—89基因株系的发芽率、根长、苗高和幼苗期综合相对盐害率与对照日本晴没有显著差异。
通过序列比较在OsEBP—89基因启动子区找到一个类似乙烯应答元件（Ethylene responsive element， ERE），称为IVC box。
ERE元件是除了GCC box 和C/DRE box 外，又一个应答乙烯信号的元件。
ERE元件是在与果实成熟相关的基因启动子中发现的，它能够应答乙烯，促进果实的成熟。
在OsEBP—89基因启动区还存在可能参与乙烯应答的另一个C/DRE元件[11]。
与DRE （Dehydration responsive element。