家兔肝抑素对大鼠肝癌的作用

【摘要】 目的 研究肝抑素（HC）对大鼠实验性肝癌的治疗作用和作用环节。方法 采用二乙基亚硝胺(DEN)诱导法建立大鼠肝癌模型。观察大鼠肝脏的病理改变、肝表面癌结节数、肝重/体重。以甲胎蛋白（AFP）、γ—谷氨酰转肽酶（γ—GT）和碱性磷酸酶（ALP）作为观察指标。采用流式细胞仪检测肿瘤细胞的动力学变化。结果 大剂量HC的疗效优于阿霉素(ADM)，其作用环节是阻滞了G0～G1期细胞的增殖；中等剂量HC的疗效与ADM相似，但其作用环节则是阻滞了G2～M期细胞的增殖。结论 本研究证实了HC在体内应用能抑制肝癌细胞的增殖，延缓肝癌的发生发展。 【关键词】 肝抑素；大鼠；肝肿瘤；二乙基亚硝胺 The effect of rabbit hepatic chalone on rat hepatocellular carcinoma 【Abstract】 Objective To study the therapeutic effect and protective effect of experimental hepatocellular carcinoma in rats with rabbit hepatic chalone(HC).Methods Hepatoma rats were induced by diethylnitrosamine(DEN).The changes of hepatoma nodules and ratio of liver/body weight were recorded and the alpha fetoprotein(AFP)，γ—glutamyl transferase(γ—GT) and alkaline phosphatase(ALP) and the pathological changes of livers were observed.The cellular dynamic parameters were studied by flow cytometry.Results HC of high dose group was better than adriamycin(ADM) group，the protective effect might be to postpone advancement of G0—G1 phase cells.HC of appropriate dose group was the same as ADM group，and the protective effect might be to postpone advancement of G2—M phase cells.Conclusion The HC in this study could inhibit the prolifiration of hepatoma cells and delay the forming of hepatoma. 【Key words】 hepatic chalone；rat；hepatocellular carcinoma；diethylnitrosamine 肝抑素（hepatic chalone，HC）是由生物正常肝细胞通过自分泌和旁分泌作用产生的、能抑制肝细胞增殖的一种分子量为13500的多肽蛋白质，它在肝脏的再生调节机制中发挥着重要的作用。有研究［1］发现HC对人肝癌细胞（SMMC—7721细胞株）在体外的增殖有明显的抑制作用，抑制率为77.7%，而对人胃癌细胞（BGC—823细胞株）的增殖则无抑制作用，提示HC是抑制肝癌细胞增殖的特异性因子。至于HC在体内应用是否可以抑制肝癌细胞的增殖，至今未见有文献报道，因此很有必要对HC进行深入的探讨和研究。本研究建立由二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine，DEN)诱发的大鼠肝癌模型，采用病理学、血清生化指标和细胞动力学的方法，研究HC对大鼠体内肝癌的治疗作用和作用环节。 1 材料与方法 1.1 动物分组 选取健康雄性SD大鼠（由广东医学院实验动物中心提供）60只，体重100～120g，随机分为6组(每组10只):正常组、模型组、阿霉素（adriamycin，ADM，由浙江海正药业股份有限公司生产）组和HC（本实验室提纯［2］）治疗组:A组，大剂量；B组，中等剂量；C组，小剂量。 除正常组外，其余5组大鼠在饮水中均加入0.01%DEN（Sigma公司产品），喂养90天，停止喂养DEN，然后开始治疗。 1.2 治疗方法 正常组和模型组每天1次腹腔注射生理盐水0.5ml/只，而ADM组每天1次腹腔注射ADM 3mg/kg，A组每天1次腹腔注射HC 9mg/kg，B组每天1次腹腔注射HC 3mg/kg，C组每天1次腹腔注射HC 1mg/kg。给药处理30天。 ADM剂量的选择以临床化疗剂量30mg/m2为依据，按人与大鼠间体表面积折算的等效剂量比值表计算得出。取折算得出的ADM剂量为HC的中等剂量(3mg/kg)，并由此得出HC的大剂量(9mg/kg)和小剂量(1mg/kg)。 1.3 常规检查 称体重，解剖大鼠，取出肝脏，称肝重，计算肝重比体重，记录肝表面癌结节数。 1.4 生化检测 断头取血，收集血清，用放射免疫测定法检测血清甲胎蛋白（AFP）的分泌量，用7170A型自动生化分析仪(由日本岛津公司制造)测γ—谷氨酰转肽酶（γ—GT）、碱性磷酸酶（ALP）的含量。 1.5 病理检查 统一取右叶肝组织，福尔马林液固定，石蜡包埋，制备成2μｍ厚的切片，HE染色，光镜下观察肝组织的病理变化。 1.6 流式细胞仪检测 取3块肝组织（每块约为1g），制备离散肝细胞悬液，以碘化丙啶荧光素染色显示核DNA，用流式细胞仪（美国BD公司产品，FACS Vantage）对样品进行DNA含量分析，得出各细胞周期的分布比率。 1.7 统计学方法 各组数据用x±s表示，组间比较采用t检验加方差分析。 2 结果 2.1 各组大鼠的生存率 实验结束时，各组大鼠的死亡数和生存率见表1。

表1 大鼠死亡数和生存率。

模型组5只大鼠的死亡原因均为腹腔内出血；ADM组3只大鼠的死亡原因也为腹腔内出血；A组2只大鼠的死亡原因同样为腹腔内出血；B组1只大鼠死于恶病质，3只死于腹腔内出血；C组4只大鼠的死亡原因也是腹腔内出血。 2.2 HC对大鼠肝癌病理改变的影响 尸检发现，正常组肝脏外观正常，无一例出现自发性肝癌，而模型组大鼠的肝脏明显增大，各叶散在大小不等的灰白结节，少数成巨块状。光镜下呈典型的柱状及腺管样癌巢结构，且癌巢周围肝细胞异型性明显，伴癌细胞浸润。ADM组、A组、B组与C组大鼠也均有癌结节存在，但肝表面癌结节数明显低于模型组（见表2），经统计学分析，ADM组、A组、B组与模型组的差异有显著性（P0.05）。而与ADM组相比，A、B、C三组中A组的差异有显著性（P0.05）。 在4个治疗组的病理切片中，A组有5例优于其余各组，切片显示:细胞排列有序，细胞核大小一致，核浆比例基本正常，病理有丝分裂少见，癌巢周围肝细胞异型性不明显，无癌细胞浸润。B组与ADM组相似，各有2例优于模型组，表现为:细胞排列紊乱，胞浆嗜碱性，核分裂相增多，可见多核和巨核细胞，但癌巢数明显少于模型组，且癌巢周围肝细胞异型性不明显，有少量癌细胞浸润。C组病理切片则与模型组接近。 2.3 HC对大鼠体重、肝重、肝重比体重的影响 与正常组相比，模型组大鼠的体重均明显低于正常组大鼠（P0.05），肝脏重量和肝重比体重均明显高于正常组（P0.05）。与模型组相比，ADM组、A组、B组和C组大鼠的体重均明显高于模型组（P0.05），肝脏重量和肝重比体重明显低于模型组（P0.05）。与ADM组相比，A组和B组大鼠的体重高于ADM组，肝脏重量和肝重比体重低于ADM组，但经统计学分析只有A组的差异有显著性（P0.05）（见表2）。

表2 ADM和HC对大鼠肝癌结节、体重、肝重、肝/体重比的影响 （x±s）。

注：※P0.05，vs正常组；△P0.05，vs模型组；□P0.05，vs ADM组 　　2.4 HC对大鼠血清中AFP、γ—GT、ALP的影响 与正常组相比，模型组大鼠的AFP、γ—GT、ALP水平均明显高于正常组（P＜0.05）。与模型组比较，ADM组、A组和B组大鼠的AFP、γ—GT、ALP水平均明显低于ADM组（P＜0.05）。与ADM组相比，A组大鼠的AFP、γ—GT、ALP水平均明显低于ADM组（P＜0.05）（见表3）。