不同化学限定性培养基培养重组CHO细胞的比较
【摘要】同一实验条件下,比较了Hyclone公司和Gibco公司的化学成分限定性培养基，在单克隆抗体生产过程中,对Anti—EGFR— CHO细胞系的生长状况及蛋白增长率的影响。
结果显示：两大公司的培养基各有优势。
毕业论文网 【关键词】CHO细胞系；化学成分限定性培养基；生长；增长率。
动物细胞的体外培养是近些年来发展相当迅速的一门现代生物技术。
目前大多数的动物细胞在进行体外培养时已采化学限定性培养基[1]，在细胞工程中用于生产疫苗、单克隆抗体和生物活性蛋白等生物制品是化学限定性培养基最重要同时也是最有发展前途的应用。
用M345基因重组质粒转化中华地鼠卵巢细胞（CHO）[2]，经克隆筛选的细胞系作为基因工程单克隆抗体，收获细胞上清液是生产单克隆抗体的基础。
为此，进行两种目前市售的不同化学限定性无血清培养基之间进行比较。
1 材料 1.1Anti—EGFR—CHO细胞Anti—EGFR—CHO细胞由哈药集团技术中心构建的中华地鼠卵巢细胞(CHO 细胞) 的M345高效表达株。
1.2培养基 CDM4（Hyclone）Cat NO.SH30556.02 CellBoost5（Hyclone）Cat NO.SH30865.03 CD Opti—CHO AGT（GiBCO） Cat NO.A11222—05 CD Efficient FeedC AGT(GiBCO) Cat NO.A13275—04 1.3 250ml模拟反应器（corning）、T25（corning）、T75（corning） 1.4 CO2培养箱（Thermo Scientific Heraeus）、振荡培养箱（Adolf Kuhner AG LT—X）、细胞计数仪（innovatis AG CASY）、测糖仪(SBA—50B)、离心机（飞鸽DT5—2B）、Protein A 高效液相（Agilent Technologies 1260） 2方法 2.1 细胞培养：按常规方法无血清悬浮复苏细胞到T25方瓶，细胞长成致密单层后离心、重悬分别应用不同的化学限定性无血清基础培养基传代培养（3代以上），待细胞至对数生长期后逐级扩增至250ml模拟反应器，当细胞密度4×106cells/ml，体积40ml。
分别取相同数量细胞，按照细胞密度1×106cells/ml，体积40ml，离心、重悬接种250ml模拟反应器，每组3个重复对照，37℃、120rpm振荡培养，每天取样计数，按规定流加，待细胞活率低于80%，收获细胞液。
2.2 培养方法 2.2.1 批次流加：按照2.1细胞培养方式，一次性接种细胞至基础培养基CDM4和CDOpti—CHO，培养数天，每天取样计数，观察细胞变化情况，比较两种培养液之间的差别。
2.2.2 流加培养：按照2.1细胞培养方式，一次性接种细胞至基础培养基CDM4和CDOpti—CHO，培养第2、4、6、8天分别开始流加10%CellBoost5或10%FeedC两种流加培养基，每天取样计数，观察细胞生长情况及蛋白表达量增长情况，比较培养液之间的差别。
2.3蛋白含量测定：分别收集的细胞培养液高速离心(15 000 r/ min)除细胞碎片, 利用Protein A 高效液相检测培养液中蛋白含量 2.3.1确定Protein A柱检测限：将纯蛋白样品稀释至终浓度为15 mg/L，上样量分别为0.10 ml、0.20 ml、0.30 ml、0.40 ml、0.50 ml，根据说明中介绍的方法进行检测，确定检测限。
2.3.2验证Protein A柱载量：将纯蛋白样品稀释至终浓度为1500 mg/L，上样量分别为0.10 ml、0.20 ml、0.30 ml、0.40 ml、0.50 ml，根据说明中介绍的方法进行检测，确定载量。
2.3.3建立HPLC检测方法：在2.3.1和2.3.2的基础之上，结合培养液中蛋白含量的情况，将蛋白样品稀释至终浓度为70 mg/L，上样量分别为0.10 ml、0.30 ml、0.50 ml作为标准品；上样量分别为0.20 ml、0.40 ml作为未知品，根据峰型的积分面积的比较，计算出未知品的蛋白含量。
同时，确定标准品的上样体积。
2.3.4蛋白含量的检测：自动进样器进样体积为0—100μl，建立标准曲线过程中标准品浓度低于0.03125mg/ml时，峰面积变异系数大于5%，无法使用，所以检测限为0.03125mg/ml，满足检测要求。
3结果 4 结论 单克隆抗体在哺乳细胞中的表达受很多因素的影响，如培养基、PH、DO、温度等[3]，因此需要考虑的综合因素很多。
本文着重研究了不同厂家生产的化学限定性培养基对单克隆抗体产量及细胞生长情况的影响。
不同厂家化学限定性培养基的组成对单克隆抗体的产量及细胞生长有着十分显著的影响。
从细胞生长的情况来看GiBCO公司的CD Opti—CHO和CD Efficient FeedC组合模式优于Hyclone公司的CDM4和CellBoost5组合模式。
从单克隆抗体蛋白增加率的情况来看Hyclone公司培养基的表现优于GiBCO公司培养基。
出现这种情况的原因可能是Anti—EGFR—CHO细胞系本身的细胞性质所决定的，GiBCO公司培养基的成分更加适合细胞系的生长，Hyclone公司培养基更加适合抗体的蛋白表达。
参考文献 [1]徐新来，鄂征.无血清培养基.见：鄂征，主编.组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1994．63． [2]申烨华，耿信笃.CHO细胞表达系统研究新进展[J].生物工程进展.2000，20(4)：23―25． [3] 林福玉，陈昭烈等. 大规模动物细胞培养的问题及对策.生物技术通报，1999，1：33。