加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原影响的实验研究

作者：郑旭锐，孙守才，李长秦，胡建军。

【摘要】 　　目的观察加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原的影响效果，从而探讨该方抗肝纤维化的机理。方法采用二甲基亚硝胺腹腔注射制备大鼠肝纤维化模型，加味四逆散灌胃给药，免疫组织化学方法检测分析各组大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原的含量。结果加味四逆散能明显降低肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原的含量，与病理模型组比较有显著性差异（P0.05）。结论加味四逆散可有效的减少肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原的沉积，对肝纤维化有肯定的治疗作用。

【关键词】 加味四逆散； 肝纤维化； Ⅰ型胶原； Ⅲ型胶原； Ⅳ型胶原。

Abstract：ObjectiveThe mechanism of Chinese herbail compound JIA WEI SI NI SAN in treating hepatic fibrosis were explored and studied by observing the expression of Collagen Ⅰ，Ⅲ and Ⅳ Collagen in liver.MethodsThe rat fibrosis model was induced by DMN. The groups of treatment were fed with JWSNS gavage. Ⅰ，Ⅲand Ⅳ collagen were detected in liver samples with immunohistochemisty. ResultsUpon pathological examination ,the JWSNS treatment had significantly reversed DMN—induced liver fibrosis . In JWSNS treatment group the expression of collagen Ⅰ,Ⅲand Ⅳcollagen in liver was markedly reduced respectively according to immunohistochemisty analysis as compared with model group（P0.05）. ConclusionThe mechanism of treating hepatic fibrosis with JWSNS appears to due to the enhancement of degradiation of collagen in liver. JWSNS can treat hepatic fibrosis effectively.

Key words：JWSNS ； Hepatic fibrosis ； Collagen Ⅰ； Collagen Ⅲ； Collagen Ⅳ 　　加味四逆散是治疗慢性病毒性肝炎的有效经验方，既往的临床观察和动物实验研究已经证实该方具有良好的防治肝纤维化作用［1～3］。本研究观察加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ型胶原（CoL—Ⅰ）、Ⅲ型胶原（CoL—Ⅲ）、Ⅳ型胶原（CoL—Ⅳ）影响效果，探讨加味四逆散抗肝纤维化的药理机制、作用环节。

1 材料。

1.1 动物 雄性SD大鼠50只，体重（180±20）g，由第四军医大学实验动物中心提供。

1.2 药物及试剂 加味四逆散煎剂（由柴胡、枳壳、白芍、甘草、黄芪、丹参、桃仁等药组成），药物加水浸泡常规煎煮，过滤，水浴蒸发至每毫升含生药3.75g，置于4℃冰箱保存备用。秋水仙碱（云南医药集团云南药业有限公司）；二甲基亚硝胺(DMN，美国Sigma公司)；CoL—Ⅰ，CoL—Ⅲ，CoL—Ⅳ抗体（均为0.1 ml兔抗鼠浓缩型，武汉博士德生物制品公司）。免疫组化试剂盒由第四军医大学免疫组化室提供。

2 方法。

2.1 模型制备 50只大鼠随机选取8只作为空白对照组（A ），其余42只均用二甲基亚硝胺（用生理盐水稀释至5 mg/ml）以10 ml/kg体重腹腔注射，1次/d，每周连续3 d，连续4周。

2.2 分组 4周造模结束后，42只大鼠共死亡10只，死亡率为23.8%，将剩余32只造模大鼠随机分为：病理模型组（B）12只 ；秋水仙碱组（C）10 只；中药组（D）10只。

2.3 给药A、B组：以生理盐水4ml/只灌胃；C组：以秋水仙碱0.01mg/kg体重灌胃；D组：以加味四逆散煎剂20ml/kg体重灌胃。以上各组用药均1次/d，连续用药30d后结束。

2.4 标本采集与制备 实验结束时，B组大鼠死亡2只，死因可能为肝纤维化未经治疗进行性加重导致肝硬化腹水而死亡。将其余存活大鼠断头处死取新鲜肝组织左叶，10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，片厚5μm。

2 .5 观测指标及测定方法。

2.5.1 一般表现 精神、活动、饮食、皮毛、粪便等。

2.5.2 普通病理组织学检查 将各组石蜡切片均行常规HE染色及胶原纤维染色。光镜下观察。病理组织学分级标准为［4］：“—”级：正常肝脏或无明显胶原纤维增生；“±”级：胶原纤维增生，中央静脉和汇管区有少量纤维索放散延伸，但无间隔形成；“+”级：胶原纤维增生，中央静脉和汇管区结缔组织变厚，由此向四周伸出纤维索，形成不完全间隔；“++”级：胶原纤维大量增生，有个别菲薄的完全间隔形成（假小叶）；“+++”级：完全间隔较厚，假小叶大量形成。

2.5.3 肝组织CoL—Ⅰ、CoL—Ⅲ、CoL—Ⅳ免疫组化观察石蜡切片，免疫组化染色按试剂盒说明进行，SP染色法，DAB法显色。CoL—Ⅰ，CoL—Ⅲ，CoL—Ⅳ含量以半定量的分级方式，根据显色深浅，分布范围及密度，分别划为4个等级［5］。0级：阴性；1级：较少，着色浅，高倍镜下明确阳性；2级：少量，着色中等，低倍镜下明确阳性；3级：大量，条索状或小片状分布，着色深。

2.6 统计学处理方法 采用Ridit分析。