碱性成纤维细胞生长因子促进兔缺血后肢 血管新生的实验研究

【摘要】目的：了解局部应用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对促进兔缺血后肢血管新生的作用。方法：25只日本大耳白兔随机分2组，外科结扎切断各兔股动脉及其分支，制作兔后肢缺血模型。试验组各兔在缺血后肢肌肉内多次注射重组人bFGF蛋白（n=15）；对照组给予等剂量生理盐水（n=10）。术后4周，各兔行腹主动脉造影观察侧支血管形成情况，取内收肌和腓肠肌肌肉行病理切片HE染色应用图像分析系统统计血管密度，并用免疫组织化学方法检测内收肌和腓肠肌中VEGF阳性表达的血管数。结果：试验组兔侧支循环血管条数、血管密度及VEGF阳性表达的血管数均大于对照组（P＜0.01），缺血状态得到改善。结论：在兔缺血后肢肌肉中注射bFGF蛋白可促进血管新生，增加兔缺血后肢血液灌注，改善肢体缺血状态。

【关键词】缺血・成纤维细胞生长因子・新生血管化，生理性・兔。

Basic fibroblast growth factor(bFGF) improves the angiogenesis of the ischemic limbs in rabbits。

【ABSTRACT】Objective:To evaluate the effect of local application bFGF on angiogenesis in ischemic limbs of rabbits.Methods:After ischemia models were induced by surgical ligation and cutting off left femoral artery in each rabbit,rabbits were randomized to received intramuscular injection of recombinant human bFGF(n=15)or normal saline(n=10)in ischemic zone.Four weeks later, angiogenesis of ischemia models were observed and evaluated by abdominal aortography,histopathologic analysis and immunohistochemical studies with the antibodies of VEGF.Results:The number of capillaries,the compensatory circulation blood vessel and the vascular endothelial cells that expressed VEGF protein in bFGF group is more than those of saline group(P＜0.01).Conclusion:Intramuscular injection of recombinant human bFGF can improve the angiogenesis of the ischemic limbs is rabbits.

【KEY WORDS】Ischemia・Fibroblast growth factor・neovascularization physiologic・Rabbtis。

研究表明，缺血心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor ,bFGF）可改善心肌功能，减少梗死面积，增加缺血区小动脉毛细血管数量等作用［1，2］。本实验通过兔缺血后肢肌肉内注射bFGF蛋白 ，观察兔缺血组织血管新生情况及缺血组织血液灌注改善情况。

1 材料和方法。

1.1 材料 成年健康日本大耳白兔25只（由河南省动物实验中心提供），体重2.5～3.0kg，平均2.8kg，雌雄不限。完全随机分组：对照组（缺血后肢肌注生理盐水）（n=10），实验组（缺血后肢肌注bFGF）（n=15）。重组人bFGF蛋白（rhbFGF）（购自北京双鹭药业有限公司），76%复广泛影葡胺（购自上海旭东海普药业有限公司），兔抗兔VEGF多克隆抗体（购自武汉博士德生物技术有限公司），SP9000二步法免疫组织化学检测剂盒、DAB显色试剂盒（购自北京中山生物技术有限公司）。

1.2 兔下肢缺血模型 各兔肌注氯胺酮（50mg/kg）获得麻醉效果后，无菌条件下经左侧腹股沟韧带中点（摸到股动脉搏动后）做一纵形皮肤切口2cm，暴露股动脉后， 自股动脉起始部分分离股动脉，在股动脉起始处，用1号丝线结扎并切断，制成兔后肢缺血模型。

1.3 实验方法 兔后肢缺血模型备制成功3h后，试验组各兔给予bFGF2000U（约5μg，用生理盐水溶解成2ml）,分5点在股动脉结扎处下方肌肉内注射。按此法第3、5、7天各给药1次，共给药4次；对照组按此法给予等剂量生理盐水。

1.4腹主动脉造影 术后4周，各兔肌注氯胺铜（50mg/kg）麻醉成功后，开腹，找到腹主动脉 （肾动脉以下段），分离2cm。用5号头皮针刺入，加压快速推入76%复方泛影葡胺10ml。在推入造影剂过程中观察兔左后肢侧支循环显影情况并摄 X线片。观察侧支循环和新生血管的形成情况。见图1。

1.5 组织切片和测量微血管密度 腹主动脉造影后立即处死各兔，取左后肢内收肌和腓肠肌中段肌肉各1cm×1cm×0.3cm大小，甲醛固定，石蜡包埋，按肌肉横断面切片，片厚5μm，连续5张，取第4张行HE染色（在郑州大学医学院病理教研室进行）。使用Biosens Digital Imaging System(V1.6)图像分析系统（郑州大学医学院人体解剖教研室提供），在400倍视野下对切片计算血管密度。见图2（略）。

1.6 检测VEGF阳性表达的血管数 取石蜡包埋的内收肌和腓肠肌标本，按肌肉横断面切片，片厚5μm，免疫组织化学染色实验步骤按照SP9000二步法免疫组织化学检测试剂盒提供的说明书进行。血管内皮细胞胞浆染色呈棕黄色者为阳性细胞，该毛细血管即为VEGF阳性表达的血管。每一标本随机选取5个视野，在400倍显微镜下观察计数VEGF阳性表达的血管数，取其平均值。见图3（略）。

1.7 统计分析 所得数据用SPSS11.5软件分析，数据x±s表示，行成组资料用t检验（α=0.01），以P＜0.01为有统计学意义。