膜片钳技术在中药对心肌钙离子通道作用研究中的应用
【摘要】 膜片钳技术自发明以来，被广泛用于生物学、生 理学 、药理学等多种学科的基础 研究 和 应用 研究中，为解决生物学跨膜信号传导 问题 提供了革命性的检测手段。 目前 该技术已运用于中药对离子通道作用的研究中，尤其是心肌钙离子通道。本文综述了近年来中药对心肌钙通道的作用。
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The Application of Patch Clamp in the Research of Traditional Chinese Medicine on Cardiac Muscle Calcium Channels 代写论文。
Abstract：Patch clamp technique has been widely applied to the basic and application research of biology,physiology,pharmacology since it was invented.And it offers revolutionary test method for biological signal transduction.Recently the technique has been used in the research of the impact of traditional Chinese medicine on ion channels,especially for cardiac muscle calcium channels.The paper made a brief review on the effect of traditional Chinese medicine on calcium channels. 论文网。
Key words:patch clamp;traditional Chinese medicine;calcium channels。
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膜片钳技术是以微弱电流信号测量为基础,利用玻璃微电极与细胞膜封接来测量多种通道电流,其测量值可达到皮安级(pA,10—12A),是一种典型的低噪声的测量技术。膜片钳技术的问世给细胞生物学的研究带来了一场革命。当前该技术已经成为细胞电生理学的重要研究 方法 。尤其是该技术近年来渗透到中医药研究的各个领域,对中医药研究水平的提高起到了很大的推动作用。 代写论文。
膜片钳的基本原理是利用负反馈 电子 线路，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗数值可达10～100GΩ。由于此阻值如此之高，故基本上可看成绝缘，其上之电流可看成零。此密封不仅电学上近乎绝缘，在机械上也是较牢固的。此时可通过膜片钳放大器，选用不同的记录模式（细胞吸附式cell—attached，全细胞模式whoel—cell等）对细胞进行电压和电流钳制，记录各种离子通道电流、细胞的静息膜电位及动作电位等。 论文代写。
1958年Fart和Katz等率先发现了钙离子通道(L型钙通道),目前已证实心肌细胞上存在B型、L型和T型三种钙通道且后二者属电压依赖性通道(Voltage dependent channels ,VDCs)。B型钙通道即背景钙通道(background Ca2＋ channels)，是静息钙通道；L型(long—lasting)钙通道是细胞兴奋过程中钙离子内流的主要途径；T型（transient）钙通道的功能与维持细胞自律性和低膜电位(接近静息膜电位)时钙的跨膜运动有关。心肌细胞上的L型钙通道，其启闭对动作电位平台期的形成、细胞内钙离子增高以及心肌细胞的电生理特性等起重要作用。
目前膜片钳技术的应用主要在以下几个方面：①离子通道特性的研究；②离子通道活动调控的研究；③离子通道生理与病理情况下作用机制的研究；④单细胞形态与功能关系的研究；⑤药物作用机制的研究。对中药研究而言，现阶段主要使用膜片钳单通道或者全细胞技术，观察中药对离子通道特性的 影响 来解释药物作用的机理，这将有利于阐明中药在细胞水平的作用机制。我们通过中药提取物对心肌各种钙通道的影响研究，来探讨其防治心率失常、强心的作用机制，或者发现其引起心率失常的离子通道原因。
3.1 人参。
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现代 研究发现人参根中含有多种人参皂甙。包括齐墩果酸型人参皂甙单体R0，人参二醇组皂甙Rc,Rd，人参皂甙Rg1，人参三醇组皂甙单体Rh等。 论文网。
齐墩果酸型人参皂甙单体R0(200 μmol/ml)对心肌L、B、T型3种类型钙通道的活动均无影响［1］。但是人参皂甙Rg1、人参二醇组皂甙Rc,Rd（1 500 μg/ml）、人参三醇组皂甙单体Rh（160 μmol/L）可使心肌钙通道的平均开放时间缩短,平均关闭时间延长,开放概率减小，但对3种类型钙通道的电流幅值无明显影响,其作用与异搏定相似,与Bay K 8644相反［2～4］。通过与钙通道阻滞剂异搏定（37.5 μg/ml）、钙通道激动剂BAY K 8644(5 nmol/L)的对照实验,证明人参二醇组皂甙Rc（200 μg/ml）对钙通道有阻滞作用而Rd（200 μg/ml）则无此作用［5］。 毕业论文。
3.2 粉防己碱 论文代写。
粉防己碱是从防己科多年生木质藤本植物粉防己中提取的。运用膜片钳单通道技术研究发现0.3～300 μmol/L粉防己碱浓度依赖性地阻滞 L型钙电流,半数抑制浓度IC50为13.3 μmol/L，但对其电流—电压曲线无明显影响［6］。全细胞记录研究［7］却发现1 μmol/L粉防已碱可使电流—电压曲线的各电流值均降低，0.1～3.2 μmol/L使钙电流呈浓度依赖性降低,IC50为0.7 μmol/L。此外,0.3 μmol/L就能阻滞异丙肾上腺素0.1 μmol/L引起的钙电流增大。虽然两者在实验具体结果上有差异，但仍证明粉防己碱可阻滞心肌细胞L型钙电流。
3.3 丹参 论文代写。
丹参为活血化瘀的代表药之一，除含脂溶性非醌类成分，丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ—A等外，还有水溶性成分。全细胞记录实验表明,丹参酮Ⅱ—A10、20和40 μmol/L可使L型钙电流的峰值分别减少35.2%、57.7%和74.7%,但对最大激活钙电流的电压依赖曲线及稳定激活曲线无影响［8，9］。同样使用全细胞记录，经过20 min的缺氧以及5 min的复氧后,50、100、200 mg/L丹参分别将兔心室肌细胞L型钙通道电流的峰值从(667.9±158.7)pA减小至(537.1±121.3)pA、(497.2±47.9)pA、(343.8±73.1)pA［10，11］。显然,丹参酮Ⅱ—A具有类似异搏停样L型钙通道阻断剂作用,其阻断作用呈非电压依赖性；丹参能有效地减少缺氧复氧后心室肌细胞的L型钙电流,这种作用可能是其抗心肌缺血以及抗缺血再灌性心律失常的机制之一。
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3.4 三七皂甙。
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通过全细胞膜片钳技术观察：三七皂甙Rb1 10 μmol/L和30 μmol/L分别使Bay K 8644和nifedipine敏感的钙内向电流（即L型钙电流）减少16.2%±3.7%和38.3%±10.4%,且在3—1000 μmol/L范围内,其抑制作用呈浓度依赖关系；同剂量的三七皂甙Rg1对该电流无明显影响［12～13］；三七总皂甙100 mg/L和300 mg/L对大鼠心肌细胞L型钙电流的抑制率分别为(26.73±4.5)%和(49±19.6)%［14］。因此可以认为三七总皂甙、Rb1为L型钙通道阻滞剂而Rg1对其无抑制作用。 代写论文。
3.5 黄芪 毕业论文。
研究发现黄芪对L型钙电流有双向调节作用。它一般不影响正常心肌细胞L型钙电流的幅度,但可抑制病毒感染细胞L型钙电流的增加,从而防止病毒感染可能导致的细胞内钙超载,对感染细胞起到保护作用［15］。这可能是黄芪用于心肌炎 治疗 的作用机制之一。另一方面，黄芪还具有恢复受抑制的L型钙电流的作用。急性心肌梗死1周时，兔梗死周边区心室肌细胞L型钙电流受到抑制,电流—电压关系曲线(I—V)上移,失活曲线左移,半数最大失活电位由—13.1±4.2 mV左移至—25.9±7.0 mV,失活速度加快［16］。这可能是急性心梗后室性心律失常发生的原因之一。使用黄芪后，缺血引起的L型钙电流的抑制有部分改善。
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3.6.1 具有钙通道激活作用的中药 黄连素［17］、异马钱子碱［18］、甘草次酸［19］、银杏苦内酯B［20］均具有类似钙通道激活剂的作用，但是具体机制又各不相同。黄连素、甘草次酸、银杏苦内酯B可使心肌钙电流明显增加，用异搏定可逆转黄连素的上述作用。小剂量的甘草次酸可使L型钙电流峰值增加，提示甘草次酸可增加L型钙电流,使心肌细胞内钙浓度增加。银杏苦内酯B对生理状态下心肌细胞L型钙电流无明显作用。但可逆转缺血引起的L型钙电流降低，还能使由于缺血而上移的I—V曲线回复正常。异马钱子碱虽然可以激活T型、L型、B型3种钙通道的活动,使其开放时间延长,关闭时间缩短,开放概率增加,但对电流幅度无明显影响。
3.6.2 具有钙通道抑制作用的中药 白花前胡甲素［21］、钩藤碱［22］、川芎嗪［23］、丹皮酚［24］、芍药苷［25］都是浓度依赖性地抑制心肌细胞L型钙通道。而牛磺酸［26］、灯盏花素［27］减少心肌细胞L型钙电流的作用具有明显的电压依赖性和浓度依赖性。