Lipstatin高产菌株筛选
【摘要】 以毒三素链霉菌XC—lp—2的变株OT—3为出发菌株，经UV和微波复合诱变处理，并在含豆油的平板上定向筛选耐豆油突变株，获得了高产突变株XC—lp—69，其lipstatin发酵效价达到911μg/ml，较出发菌株OT—3提高了71.6%。传代试验表明突变株XC—lp—69的高产遗传特性稳定。
【关键词】 Lipstatin； 菌种选育； 诱变； 毒三素链霉菌。
ABSTRACT After Stretomyces toxytricini OT—3 was treated by UV and microwave irradiation, the soybean oil tolerant mutants were screened and a high—titre strain XC—lp—69 was obtained. The productivity of strain XC—lp—69 reached 911 μg/ml, which is 71.6% more than that of the starting stain OT—3. The subculture experiments indicated that the hereditary character of high productivity of strain XC—lp—69 is stable.
KEY WORDS Lipstatin; Strain breeding; Induced mutation; Streptomyces toxytricini。
收稿日期：2006—11—29。
作者简介：韩俊茹，女，生于1966年，女，硕士。研究方向：生物制药。
Lipstatin(利普司他汀)是毒三素链霉菌(Stretomyces toxytricini)的代谢产物，能选择性抑制胃肠道中胰脂肪酶的活性，减少脂肪的分解和吸收，其四氢衍生物奥利司他(orlistat)已被Roche公司开发为减肥药(商品名：赛尼可，Xenical)［1，2］，是目前唯一一个作为非中枢神经系统作用上市的治疗肥胖症的药物［3］。因此，发酵法生产lipstatin备受关注。
提高lipstatin的发酵生产水平主要依赖于菌种选育和发酵工艺(培养基和培养条件)的优化这两个相辅相成的环节。本文采用紫外线照射和微波交替处理，并结合豆油耐受性菌株的理性化筛选，选育lipstatin高产菌株，获得了高产突变株XC—lp—69，发酵水平较原始菌株(XC—lp—2)提高了2倍多，且该菌株经多次传代后高产特性稳定性较好。
1 材料与方法。
1.1 菌种。
毒三素链霉菌(Stretomyces toxytricini)XC—lp—2由浙江医药股份有限公司新昌制药厂提供， 发酵效价300μg/ml左右。
1.2 培养基。
(1)斜面及分离平板培养基(g/L) 可溶性淀粉10.0，蛋白胨5.0，KNO3 2.0，NaCl 2.0，KH2PO4 2.0，琼脂20.0，去离子水配制，pH6.8～7.0。
(2)摇瓶种子培养基(g/L) 冷榨黄豆饼粉15.0，甘油15.0，酵母膏7.5，豆油5.0，KNO3 2.0，MgSO4·7H2O 1.0，自来水配制，pH7.0～7.2。
(3)发酵培养基(g/L) 冷榨黄豆饼粉30.0，甘油20.0，大豆卵磷脂12.0，酵母粉10.0，豆油5.5，自来水配制，pH7.0～7.2。
1.3 培养条件。
(1)斜面培养条件 培养温度(30±0.5)℃，相对湿度35%～50%，培养时间120～150h。
(2)种子培养条件 培养温度27℃，250ml三角瓶装量25ml，转速240r/min，培养时间20～24h。
(3)发酵培养条件 培养温度27℃，250ml三角瓶装量25ml，转速240r/min，培养时间120h。1.4 诱变处理。
(1)紫外线照射 将单孢子悬浮液置紫外诱变箱(紫外灯功率30W，波长253nm照射垂直距离30cm)中诱变处理一定时间，用黑布包好，在红灯下用无菌水做梯度稀释后涂布平板，30℃避光培养5～6d，挑单菌落传斜面。
(2)微波处理 将单孢子悬浮液置于灭菌10ml试管中，在500ml烧杯中冰浴；然后将冰浴烧杯连同试管放入800W的微波炉中，功率开至中档，照射一定时间，经梯度稀释后涂布平板，30℃培养5～6d，待菌落成熟后挑单菌落传斜面。
将经过UV照射、微波处理或两者交替处理后得到的孢子悬液梯度稀释后，分别涂布于含一定豆油浓度的分离平板上，30℃培养。
1.6 分析方法。
试样制备 取发酵液10ml，4000r/min离心15min，上清液用丙酮1∶4的比例稀释摇匀浸泡1h，取上清液再次10000r/min离心3min或膜过滤，取清液进行HPLC测定胞外效价，并用同样的方法测定菌丝体沉淀中的产物量(胞内效价)。本文中发酵效价为胞内外效价之和。
HPLC色谱条件 色谱柱C18 ODS(4.6mm×250mm，5μm)，柱温35℃，检测器DAD(HP1100)，检测波长210nm，流动相为乙腈∶水(86∶14)，流速0.8ml/min。