结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂注册技术审查指导原则（2018年）
附件 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂 册技术审指导原则 指导原则旨指导册申请人对结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂册申报准备及撰写也技术审评部门对册申报技术审评提供参考。
指导原则是对结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂般要申请人应依据产品具体特性确定其容是否适用如不适用具体阐述理由及相应科学依据并依据产品具体特性对册申报容进行充实和细化。
指导原则是对申请人和审人员指导性件但不包括册审批所涉及行政事项也不作法规强制执行如有能够满足相关法规要其他方法也可以采用但要提供详细研究和验证相关人员应遵循相关法规前提下使用指导原则。
指导原则是现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定随着法规和标准不断完善以及科学技术不断发展指导原则相关容也将适进行调整。
、围 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应（即γ干扰素释放试验GR）主要原理受到结核分枝杆菌抗原刺激致敏淋巴细胞（细胞）再次遇到相抗原可产生γ干扰素GR通检测全血或者分离全血外周血单核细胞（B）结核分枝杆菌特异性抗原刺激下产生γ干扰素判断受试者是否存结核分枝杆菌感染。
目前国际上较成熟GR有两种是采用酶免疫吸附实验（L）方法检测全血致敏细胞再次受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激释放γ干扰素水平；二是采用酶免疫斑技术（L）方法测定结核分枝杆菌特异性抗原刺激下外周血单核细胞能够释放γ干扰素效应细胞数量。
上述两种检测方法原理类似检测技术和操作程序略有不采用结核分枝杆菌特异性抗原主要存结核分枝杆菌复合群卡介苗和多数非结核分枝杆菌缺失。
目前结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂是指利用免疫学检测技术如L或L技术等以结核分枝杆菌特异抗原刺激细胞产生γ干扰素检测靶标对人静脉全血结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应进行体外检测试剂可用结核分枝杆菌感染检测或用结核病辅助诊断。
指导原则所述容是针对结核病辅助诊断预期用途对预期用途结核分枝杆菌感染检测申报试剂申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他评价和验证。
指导原则技术要是基L和L方法建立对其他方法可能部分要不完全适用或所述技术指标不够全面申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他评价和验证但阐述不适用理由并验证替代方法科学合理性。
指导原则适用进行首次册申报和相关许可事项变更产品。
二、册申报要 （）综述 综述主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性说明、研究结总结评价以及国外类产品上市情况介绍等容。
其类产品上市情况介绍部分应着重从预期用途、方法学、检验原理、结核分枝杆菌特异性刺激抗原以及低检测限等方面写明申报试剂与目前市场上已获批准类产品主要区别。
如所用刺激抗原新发现结核分枝杆菌特异性抗原则应详细论述其能提高该类试剂灵敏和特异性科学依据并提供充分支持。
综述应合《体外诊断试剂册管理办法》（国食品药品监督管理总局令5以下简称《办法》）和《关公布体外诊断试剂册申报要和批准证明件格式公告》（国食品药品监督管理总局公告0年以下简称公告）相关要。
（二）主要原材研究 应提供主要原材如抗原肽重组抗原、抗体、阴性对照、阳性对照、标准品（γ干扰素）、酶以及企业参考品等选择与、制备程、质量分析和质量控制标准等研究。
如主要原材企业己生产其生产工艺必须相对稳定；如主要原材购其他供应商应提供包括供应商提供质量标准、出厂检定报告或性能指标证以及该原材到货质量检验。
对采用L方法申报试剂企业参考品至少应包括阴性参考品、阳性参考品和精密参考品。
其阳性参考品建议采用结核病患者（菌阴和菌阳）全血阴性参考品建议采用健康人和其他易混淆疾病患者全血精密参考品建议采用结核病患者全血。
如申请人采用除全血外其他样形式作企业参考品请提交申请人所采用企业参考品组成、、稳定性、延续性、性能可控性等详细理论和试验数据。
对采用L方法申报试剂企业参考品至少应包括阴性参考品、阳性参考品、低检测限参考品、线性参考品、准确参考品和精密参考品等。
其阴性参考品、阳性参考品和精密参考品设置可参考L方法申报试剂相关要。
低检测限参考品、准确参考品和线性参考品主要考察L部分性能可采用含有γ干扰素溶液（建议采用血浆作基质溶液）。
对阴性阳性对照申报试剂质控体系通设置阳性、阴性对照实现申报应详细描述各种对照原选择、制备、定值程等试验。
指导原则技术要是基L和L方法建立对采用上述方法学结核细胞类检测试剂建议至少设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照般采用外周血单核细胞非特异性刺激物用质控外周血单核细胞功能是否正常避免产生假阴性。
阴性对照用控制细胞活化程所产生各种因子非特异性影响避免产生假阳性。
标准品（如适用）选择及质量标准应详细描述标准品原、制备、纯、浓（或复溶浓）、分子量、功能活性等确定和验证。
多肽重组抗原选择及质量标准应详细描述多肽（何种抗原）重组抗原、组成、分子量、纯、浓、重组抗原毒素含量、刺激活性、特异性等确定和验证。
如冻干抗原还应设置水分含量质控标准。
抗体选择及质量标准应详细描述抗体、纯、浓、分子量、刺激免疫原、效价和功能活性等确定和验证。
（三）主要生产工艺及反应体系研究 主要生产工艺包括配制工作液、分装和包装等可用流程图表示。
应提供主要生产工艺确定依据包括试验方法和数据等。
反应体系研究应能对产品说明检验方法部分涉及基容如样用量、试剂用量、反应条件等提供确定依据包括试验方法和数据等。
（四）分析性能评估 申请人应提交对申报试剂进行所有性能验证研究包括具体试验方法、控标准、实验数据和统计分析等。
对结核分枝杆菌细胞免疫反应检测试剂建议着重对以下分析性能进行研究。
对采用L方法申报试剂 检验方法分两部分（）将结核分枝杆菌特异性抗原与全血样共培养获得含有γ干扰素血浆样；（）以γ干扰素标准品做标准曲线对（）步血浆样采用L方法进行定量检测。
基该方法学分析性能要对上述两方面性能进行验证。
建议采用含有系列γ干扰素稀释浓样对每浓样进行多次重复检测选取测定平值0浓测定平值+浓作低检测限浓。
线性围 线性围确定研究应使用高值样（采用血浆基质采用可溯至国际校准品方法对血浆样γ干扰素进行定量）进行梯稀释稀释液应使用血浆应包含接近低检测限临界值浓。
3准确 可采用如下方法进行评价如与国际标准品偏差分析、回收试验或者方法学比对等方法申请人可根据实际情况选择合理方法进行研究。
分析特异性 交叉反应 交叉反应验证主要考虑全血身含有细胞因子或全血刺激培养程产生细胞因子与申报试剂所用γ干扰素抗体对是否存交叉反应。
要进行交叉反应验证细胞因子包括Lα、Lβ、L、L3、L、L5、L6、L0、L、α、α和β等。
建议申请人采用定数量其他常见分枝杆菌感染患者全血样进行试验评价申报试剂特异性。
干扰物质 应对全血样常见干扰物质进行验证包括抗凝剂、甘油三酯、血红蛋白、胆红素、类风湿因子、抗核抗体、抗线粒体抗体和免疫抑制剂等。
建议采用含有不浓γ干扰素血浆样分别进行干扰物质验证给出不会对γ干扰素检测值产生干扰高干扰物浓。
5精密 5采用全血样进行试验精密分别采用阳性全血样和阴性全血样进行不少0次重复检测判断检测结阴阳性多次重复检测结应致。
5采用含有γ干扰素血浆样进行试验精密建议γ干扰素低浓和等浓浓水平分别进行验证。
53申请人应设置合理精密评价周期以便对批批以及不操作者精密进行综合评价。
6阴性参考品合率 建议选择至少5份健康人和其他易混淆疾病患者全血样进行试验上述健康人和患者应包括不等级结核菌素（）皮试人群。
7阳性参考品合率 建议选择至少0份结核病患者（至少0例菌阳至少0例菌阴）全血样进行试验。
8标准品溯 γ干扰素具有国际标准品建议检测结量值溯至国际标准品。
申请人应提供从国际标准品到产品标准品溯链以及各级赋值。
对采用L方法申报试剂 检验方法将结核分枝杆菌特异性抗原与分离外周血单核细胞（B）共培养活化刺激B分泌γ干扰素被微孔板上包被单克隆抗体捕获再用酶标记另单克隆抗体进行反应显色斑即代表细胞计数斑多少从而判断是否存结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应。
基该方法学分析性能从下述几方面进行性能验证。
分析特异性 交叉反应 交叉反应验证主要考虑B刺激培养程产生细胞因子与申报试剂所用γ干扰素抗体对是否存交叉反应。
要进行交叉反应验证细胞因子包括Lα、Lβ、L、L3、L、L5、L6、L0、L、α、α和β等。
建议申请人采用定数量其他常见分枝杆菌感染患者全血样进行试验评价申报试剂特异性。
干扰物质 应对全血样常见干扰物质进行验证包括抗凝剂、甘油三酯、血红蛋白、胆红素、类风湿因子、抗核抗体、抗线粒体抗体和免疫抑制剂等。
精密 采用全血样（包括高斑数样、等斑数和低斑数样）分别进行精密评价进行不少0次重复试验判断检测结阴阳性多次重复检测结应致。
还应计数检测孔斑数计算其V值V值应≤5%。
申请人应设置合理精密评价周期以便对批批以及不操作者精密进行综合评价。
3阴性参考品合率 建议选择至少5份健康人和其他易混淆疾病患者全血样进行试验上述健康人和患者应包括不等级结核菌素（）皮试人群。
阳性参考品合率 建议选择至少0份结核病患者（至少0例菌阳至少0例菌阴）全血样进行试验。
（五）阳性判断值研究 类试剂阳性判断值较复杂阳性判断值对应产品说明“检验结释”部分容申请人应对产品说明“检验结释”部分所涉及各数值提供详细确定和验证。
该部分应采用临床样进行试验请临床样选择应与申报产品声称预期用途相致。
建议采用受试者工作特征（R）曲线方式进行确定。
（六）稳定性研究 稳定性包括申报试剂稳定性和样稳定性（包括全血样稳定性和血浆样稳定性）。
前者主要包括实稳定性（有效期）、开封稳定性及冻融次数限制（如适用）等。
稳定性研究应包括研究方法确定依据、具体实施方案、详细研究数据及结论。
对实稳定性研究应提供至少三批样品实际储存条件下保存至成品有效期研究。
试剂稳定性和样稳定性两部分容研究结应说明【储存条件及有效期】和【样要】两项进行详细说明。
（七）临床试验 临床试验总体要及临床试验容应合《办法》、公告和《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（国食品药品监督管理总局通告0年6）规定以下仅结合结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂具体特对其临床试验应重关容进行阐述。
临床试验机构选择 申请人应当选定不少3（含3）临床试验机构按照法规要开展临床试验。
对比试剂选择 对预期用结核病辅助诊断申报试剂申请人可选择境已批准上市、临床普遍认质量较类产品作对比试剂采用试验用体外诊断试剂（以下称申报试剂）与对比试剂进行比较研究试验证明品与已上市产品等效。
3临床试验对象选择 对预期用结核病辅助诊断申报产品临床试验对象应满足（）临床试验总病例至少000例；（）具有结核病相关体征症状疑似结核病患者；（3）终临床诊断结核病患者病例应包括肺结核患者和肺外结核患者并且涂片阴性肺结核患者占所有肺结核患者比例不应50%；单纯肺外结核患者至少30例；（）非结核其他呼吸道疾病患者以及其他易混淆疾病患者病例（终临床诊断不是结核病）包括肺炎、肺癌、支气管炎、支气管扩张、非结核分枝杆菌病、慢阻肺等其肺癌至少50例；（5）上述人群应包括阴性和阳性人群不能人选择阴性人群进行临床试验；（6）各临床试验机构样量和样分布应相对衡。
全血样不能冻融临床试验应采用新鲜样样采集和保存等应满足申报试剂和对比试剂说明相关要。
临床试验方法、临床原始数据及统计分析 分别依据申报试剂和对比试剂各说明对入组临床样进行检测记录结。
临床报告应明确总样例数；临床诊断肺结核患者总例数说明涂片阴性和涂片阳性肺结核患者例数；肺外结核患者例数说明各类肺外结核患者例数；非结核其他呼吸道疾病患者以及易混淆疾病样例数并详细说明各类非结核疾病患者例数。
3临床原始数据应以列表方式表示包括每病例样年龄、性别、临床诊断结、申报试剂结以及对比试剂结等。
对临床试验数据统计应选择合适统计方法如受试者工作特征（R）曲线分析、阴性阳性合率等。
常选择四格表形式总结两种试剂定性检测结对定性结进行四格表卡方或k检验以验证两种试剂定性结致性统计分析应可以证明两种方法检测结无明显统计学差异。
5结差异样验证 对两种试剂检测结不致样应采用临床上公认较三方试剂或其他合理方法进行复核结合患者临床病情对差异原因及可能结进行分析。
6临床试验方案 各临床试验机构方案设置应保持致且保证整临床试验程遵循预定方案实施不可随改动。
整试验程应临床试验机构实验室并由实验室技术人员操作完成申请人技术人员除进行必要技术指导外不得随干涉试验进程尤其是数据收集程。
试验方案应确定严格样入选排除标准任何已入选样再被排除出临床试验都应记录案并明确说明原因。
7其他问题 如申报试剂预期用途结核分枝杆菌感染检测申请人应按照法规要设置合理对比方法选择合适预期适用人群进行临床试验。
（八）产品技术要 产品技术要应合《办法》和《医疗器械产品技术要编写指导原则》（国食品药品监督管理总局通告0年9）相关规定。
容主要包含产品性能指标和检验方法并附录明确主要原材、生产工艺及半成品检定要。
对采用L方法申报试剂产品技术要性能指标至少应包括外观、阴性参考品合率、阳性参考品合率、线性、准确、低检测限和精密等。
对采用L方法申报试剂产品技术要性能指标至少应包括外观、阴性参考品合率、阳性参考品合率和精密。
（九）产品册检验报告 根据《办法》要首次申请册三类产品应具有相应医疗器械检验质和承检围医疗器械检验机构进行连续三生产批次样品册检测。
（十）产品说明 产品说明格式应合《体外诊断试剂说明编写指导原则》（国食品药品监督管理总局通告0年7）要境外试剂说明除格式要外其容应尽量保持与原说明致翻译力准确且合表达习惯。
产品说明所有容应与申请人提交册申报相关研究结保持致。
结合《体外诊断试剂说明编写指导原则》要下面对结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂说明重容进行说明。
【预期用途】 应至少包括以下几部分容 产品用体外定性检测人新鲜外周静脉抗凝血结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应用结核分枝杆菌感染检测或者用结核病辅助诊断（根据临床试验等研究确认预期用途）。
说明与预期用途相关临床适应症背景情况说明相关临床或实验室诊断方法。
3待测人群特征介绍具有结核病相关体征症状疑似结核病患者、地域要或年龄限制（如有）等。
【主要组成成分】 说明试剂盒包含组分名称、数量、比例或浓等信息说明不批试剂盒各组分是否可以换。
试剂盒不包含但对该项检测必须组分应列出相关试剂耗材名称、货及其他相关信息。
3申报试剂册单元不应包含真空采血管真空采血管应按相应法规申报册。
3【检验原理】 3说明试剂盒所用刺激抗原抗原肽（名称、是否多肽抗原重组抗原）以及所用抗原抗原肽卡介苗和非结核分枝杆菌存情况。
3试剂盒技术原理详细介绍建议结合适当图示进行说明。
【储存条件及有效期】 说明试剂盒效期稳定性、开封稳定性、复融稳定性、冻融次数要（如适用）等应明确具体储存条件及有效期。
5【样要】 重明确以下容 5样采集明确所用抗凝剂。
5样保存 5对采用L方法申报试剂应明确全血样进行外周血单核细胞分离前保存温与；分离外周血单核细胞与抗原孵育培养前保存温与。
5对采用L方法申报试剂应明确全血样与抗原孵育培养前保存温与。
6【检验方法】 该类产品检测步骤繁多应详细描述从全血采集开始到结判前每步骤并明确事项。
重关以下问题对采用L方法申报试剂明确培养所用外周血单核细胞数量以及所用培养基类型。
7【检验结释】 结合阳性对照、阴性对照以及样管检测结以列表形式对所有可能出现结组合及相应释进行详述明确灰区结处理方式。
8【检验方法局限性】 8试剂盒检测结仅供临床参考对患者临床诊治应结合其症状体征、病史、其他实验室检及治疗反应等情况综合考虑。
8有关假阴性结可能性分析如某些免疫功能受损患者可能导致假阴性。
83有关假阳性结可能性分析如与其他分枝杆菌是否存交叉反应。
9【产品性能指标】 9低检测限（如适用）说明试剂低检出浓简单介绍低检测限试验方法及结。
9企业阴阳性参考品检测合情况简单介绍阴阳性参考品组成和合率结等信息。
93精密明确精密参考品组成及结。
9分析特异性 9交叉反应明确可能产生交叉反应其他细胞因子验证情况。
9干扰物质明确样常见干扰物质对检测结影响。
95对比试验研究（如有）简要介绍对比试剂（方法）信息、所采用统计学方法及统计分析结。
96境外（如适用）和境临床试验数据总结。
《结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂册技术审指导原则》编制说明 、编制背景 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂是指利用免疫学检测技术如L或L技术等以结核分枝杆菌特异抗原刺激细胞产生γ干扰素检测靶标对人静脉全血结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应进行体外检测试剂可用结核分枝杆菌感染检测或用结核病辅助诊断。
指导原则所述容是针对结核病辅助诊断预期用途对预期用途结核分枝杆菌感染检测申报试剂申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他评价和验证。
二、重问题说明 （）企业参考品组成和样类型 目前该类试剂采用全血样作检测样类型所涉及方法学包括L和L。
针对企业参考品样类型考虑到全血样不可冻存性和该类试剂质控关键指导原则建议如申请人采用除全血外其他样形式作企业参考品应提交申请人所采用企业参考品组成、、稳定性、延续性、性能可控性等详细理论和试验数据。
针对企业参考品组成由L方法是全血细胞培养直接固体基质表面形成斑计数斑判断结理论上可计数斑。
但实践很难保证获取全血样刚形成斑因采用该方法学试剂仅要设置阴性参考品、阳性参考品和精密参考品。
而L方法是全血培养吸出血浆上清检测上清干扰素含量因采用该方法学类试剂要设置培养阶段和干扰素L检测阶段参考品包括阴性参考品、阳性参考品、线性参考品、低检测限参考品和精密参考品等。
（二）分析性能评估相关问题 低检测限要与方法 采用L方法试剂理论上可计数到斑因理论上其低检测限斑但现实通试验证明该类试剂低检测限斑具有很困难难以实现。
因参考美国已批准类试剂要讨论对L方法学类试剂无进行低检测限验证。
指导原则建议申请人可根据己研发平台设置科学合理方法进行低检测限试验。
精密要与方法 采用L方法试剂精密必须采用全血进行试验方可模拟整检测程。
讨论日精密企业和相关专提出因全血样无法冻存无法不然天进行日精密研究。
现有认知水平下也无科学合理替代方法进行日精密研究因对类试剂不做日精密要。
采用L方法试剂精密不仅要考察全血培养阶段精密而且要考察L检测部分对干扰素含量检测精密前者可参考L方法相关要和方法者参考常见L方法检测试剂要和方法。
3交叉反应要与方法 采用L方法和L方法试剂尽管结判方式存差异但其检验原理是采用特异性γ干扰素抗体检测细胞刺激活化分泌γ干扰素。
因类试剂交叉反应性主要考虑全血身含有细胞因子或全血刺激培养程产生细胞因子与申报试剂所用γ干扰素抗体对是否存交叉反应。
如全血样培养程加入可能产生交叉反应细胞因子势必会影响细胞培养程功能和活性终影响细胞分泌γ干扰素能力影响对结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测。
因对该类试剂不管是采用何种方法交叉反应研究都是采用血浆或其他基质检测细胞因子对γ干扰素抗体对交叉反应性。
（三）产品预期用途 该类试剂检测原理可检测结核分枝杆菌感染包括活动性结核感染（结核病）和潜伏感染。
但是因潜伏感染诊断全世界无金标准而且国人出生就接种卡介苗导致对潜伏感染预期用途临床验证目前缺乏有效对比方法因目前申请人申报该类试剂预期用途基用结核病辅助诊断。
指导原则针对结核病辅助诊断预期用途临床试验要给出了较详细建议并专和企业讨论达成了致见。
指导原则也明确如申请人对该类试剂预期用途设定结核分枝杆菌感染检测提供足够临床证据支持该声称。
（四）临床试验相关问题 样入组相关要 针对结核病辅助诊断预期用途指导原则临床试验样入组方面做了较详细说明。
临床使用该类试剂不仅用肺结核辅助诊断还可用肺外结核辅助诊断因指导原则对单纯肺外结核样例数也给出了低要。
鉴临床实践和研究证明肺癌患者是类与γ干扰素相关癌症因规定了肺癌患者低样例数以考察该类试剂特异性。
临床特异性相关要 指导原则初稿对申报试剂临床特异性做出了不低75%要。
专和企业反复讨论删除了这要原因有以下几该类试剂已有多类产品国外批准上市按照法规要可选择已上市类试剂验证该类试剂检测准确性；二该类试剂临床特异性受临床试验受试人群年龄、性别以及区域影响较而且目前并无量流行病学调数据支持75%声称因临床特异性无法给出具体要。
三、编写单位 国食品药品监督管理总局医疗器械技术审评心。