人参皂苷Rb1对体外培养雪旺细胞作用的实验研究

作者：杨雷，刘黎军，肖建德，王大平，关瑞云。

【摘要】 目的 研究人参皂苷Rb1对体外培养雪旺细胞增殖分化的影响，探讨其促进神经再生的作用和机制。方法 选用8个月月龄的新西兰兔的坐骨神经体外培养第2代，加入不同浓度的人参皂苷Rb1，继续培养10天，相差显微镜观察计数，绘制各自的增殖曲线；在36h和72h对各组细胞进行流式细胞分析。结果 活细胞计数含20μg/ml人参皂苷Rb1组的倍增时间为5.3天，明显优于对照组(P＜0.01)；用含20μg/ml人参皂苷Rb1培养36h、72h后雪旺细胞增殖的流式细胞仪分析，处于S期的雪旺细胞较对照组明显增高(P＜0.01)。结论 人参皂苷Rb1有促进体外培养雪旺细胞快速增殖分化的作用，从而为促进神经损伤的再生途径提供一些新的药物使用基础研究。 【关键词】 人参皂苷Rb1；雪旺细胞；细胞增殖 【Abstract】 Objective To study the effects of Ginsenoside Rb1 on the proliferation and differentiation of Schwann’s cells and discuss the mechanism of nerve regeneration induced by Ginsenoside Rb1.Methods The sciatic nerve of New zealand rabbit of 8 months old was cultured in vitro and the second generation was used.Ginsenoside Rb1 with different concentrations were dropped into the culture medium for 10 days.Numbers of cells were counted by contrast microscope and proliferation curves were drawn individually.Furthermore，analysis of cells were made by flow cytometer.at 36h and 72h.Results Double proliferation time of Schwann’s cells cultured in 20μg/ml Ginsenoside Rb1 was 5.3d which superior to has was obvious difference from the control group(P＜0.01).The numbers of Schwanns cell at synthesis phase were increased significantly which cultured in 20μg/ml Ginsenoside Rb1(P＜0.01).Conclusion Ginsenoside Rb1 has the function of stimulating proliferation and idfferentiation of Schwann’s cell in vitro，and suqqests the important role in nerve regeneration. 【Key words】 Ginsenoside Rb1；schwann’s cell；proliferation and differentiation of and suqqests 雪旺细胞是周围神经再生和周围神经组织工程研究的重要细胞，不仅为神经修复提供支撑，尚可诱导神经纤维生长的方向。近年来发现［1］尚有胶质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、霍乱毒素、血小板生长因子、转移生长因子以及cAMP类似物质等，均能刺激雪旺细胞生长，但是均有其局限性。应用中药治疗周围神经的损伤在临床上确有积极的疗效。为了解周围神经损伤后人参皂苷Rb1是否可以促使雪旺细胞增殖分化，从而促进周围神经损伤后的修复问题，我们设计了本实验研究。 1 材料与方法 1.1 药品与试剂 人参皂苷Rb1购自长春白求恩医科大学基础医学实验室。DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶(含1mmolEDTA—4Na)、胶原蛋白酶和新生小牛血清为美国Gibco公司产品，L—多聚赖氨酸(相对分子质量为15万～30万，Sigma公司)；兔抗鼠S—100蛋白酶联免疫细胞化学试剂盒(北京中山生物公司)。 1.2 雪旺细胞的体外培养 选用8个月月龄的新西兰兔1只，于静脉麻醉下在双侧坐骨神经中段用1—0号线结扎神经。术后7天在静脉麻醉下对结扎神经近、远端2.0cm的坐骨神经进行取材。取材后在解剖显微镜下仔细剥离神经外膜及其周围的粘连组织后，将神经剪成0.5mm3的小碎块后种植于培养皿中，加入适量培养液(80%的DMEM，20%的小牛血清)，待雪旺细胞长满培养皿后进行纯化传代。先将组织块移出至新的预留有培养液的培养瓶内做再次移植，继之顺序应用低浓度酶快速消化法、差速贴壁分离法和抗有丝分裂法去除成纤维细胞、纯化雪旺细胞。具体方法如下［2］：(1)将0.125%胰蛋白酶液加入培养瓶中，倒置相差显微镜下观察见SC收缩后，立即终止消化，轻轻吹打，收集脱落的细胞，接种于新的培养瓶内；(2)将培养瓶移入培养箱内1h，振摇后吸出悬液重新接种；(3)重新接种的细胞培养24h后，更换含阿糖胞苷10mol/L的培养液作用48h，再换用常规培养液继续培养、传代。 1.3 雪旺细胞的增殖指数 将培养纯化后的雪旺细胞计数后按每孔10万个浓度接种在预先涂有多聚赖氨酸的24孔细胞培养板上。实验分成5组(每组12孔)：A组为空白对照组，B组为含50ng/ml神经生长因子(nerve grwoth facotr，NGF)培养液组，C组为含10μg/ml人参皂苷Rb1组，D组为含20μg/ml人参皂苷Rb1组，E组为含100μg/ml人参皂苷Rb1组。每2天换培养液1次，共作用10天。在相差显微镜下行形态学观察，每2天在每个培养皿中随机选取3个视野进行雪旺细胞计数，并做好标记；以后计数时，每个视野的标记均位于指针的尖端。并用4%甲醛将细胞固定后行S—100免疫染色，并计数染色阳性的细胞。用上述两种方法来判定雪旺细胞增殖数量及其纯度。各组比较时，以增殖指数(proliferation index，PI=各次观察细胞数/初次观察细胞数)为指标，结果用两样本均数比较的t检验进行统计学分析。 1.4 流式细胞仪检测 将培养纯化后的雪旺细胞按上述分成5组，培养48h后，吸出培养瓶中培养液，加入0.125%胰蛋白酶，加入量以能覆盖细胞为度，室温下作用2～3min。消化过程中，倒置显微镜下观察监视细胞状态，当见到细胞胞质回缩，胞体趋于变圆，细胞相互间隙变大时，立即加入20%小牛血清雪旺细胞培养液终止消化。吸出消化液，加入适量培养液，用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱落形成细胞悬液，终止消化。吹打后将细胞悬液移入离心管中，离心(1000rpm，10min)，用PBS洗涤并充分吹打成单细胞悬液，然后固定于预冷的75%乙醇30min，再次离心弃上清液，加入0.01%RNA酶，37℃水浴，振荡10min，离心(1000rpm，10min)；弃上清液，加入0.5%PI，调整细胞浓度到5000左右，避光染色30min后上机检测(波长480nm)G0/G1期之前的亚二倍体峰。 2 结果 2.1 倒置显微镜观察 显示培养6天的雪旺细胞大量增殖，连接成片，胞体较小，梭形，两侧突起纤长，胞核明显呈卵圆形或长圆形，胞体四周常有亮边，大部分呈双极突起，少数呈三极突起，细胞易呈极性排列成栅栏状，部分细胞聚成堆。雪旺细胞免疫组化鉴定：雪旺细胞对抗S—100蛋白呈阳性反应，培养6天后的雪旺细胞纯净度达95%(见图1)。 2.2 活细胞计数 对照组A组雪旺细胞的倍增时间为7.8天，B组含50ng/mlNGF培养液组的倍增时间为5.5天，C组含10μg/ml人参皂苷Rb1组的倍增时间为6.1天，D组含20μg/ml人参皂苷Rb1组的倍增时间为5.3天(8天时雪旺细胞生长情况见图2)，E组含100μg/ml人参皂苷Rb1组的倍增时间为5.6天。各组雪旺细胞的增殖曲线见图3，细胞计数统计分析，两组间均数比较进行t检验。结果B、C、D、E组与A组比较，P＜0.01。B组与D组比较，P＞0.05。 2.3 雪旺细胞增殖的流式细胞分析 测定结果B组、C组、D组、E组，在培养36h和12h后，处于S期的雪旺细胞较对照组A组有明显的提高(见表1)，两者差异有非常显著性(P＜0.01)。B组与C组、D组、E组比较，在培养36h和72h后，处于S期的雪旺细胞两者差异均无显著性(P＞0.05)。