地塞米松诱导大鼠白内障形态学及酶活性变化
作者：王建伟，严宏，王永强，哈文静，丁正华，郭勇。
【关键词】 白内障。
Alteration of morphology and enzyme activity in dexamethasoninduced cataract in rat lens。
【Abstract】 AIM: To observe the morphological features and enzyme activities in dexamethasoninduced organcultured rat lens and to study the mechanisms of steroid cataract. METHODS: One hundred lenses cultured in vitro were divided into 2 groups: control group (DMEM) and dexamethasoninduced cataract group (DMEM+dexamethason 10 μmol/L). Following incubation, the lenses were evaluated daily using a dissecting microscope. On d 1, 3, 5 and 7, 12 lenses of each group were homogenized and the activities of enzymes (catalase, superoxide dismutase, lactate dehydrogenase) were measured, respectively. Two lenses of each group were made into specimen of transmission electron microscopy for the observation of the ultrastructure on d 7. RESULTS: The lenses of control group exhibited mistlike opacity and those of cataract group had dense nuclear opacity on d 7. On d 3, the activities of catalase, superoxide dismutase and lactate dehydrogenase decreased by 34.51%, 7.78%, 15.73% respectively compared with those on d 1. On d 7, they decreased by 84.54%, 30.17%, 40.93% respectively compared with those on d 1. Under electron microscope, the arrangement of fiber cells in control group was in tidy order and the cell membrane, cell junction and organelle were normal, while in cataract group, the arrangement of fiber cells were in untidy order and the lenses consisted of abnormalappearing cells which exhibited swollen mitochondria, a large amount of vacuoles and expanded extracellular lacunae. CONCLUSION: Lenses have nuclear cataract in dexamethasoninduced organcultured rat lens. Oxidative stress may be involved in the steroidinduced cataract formation.
【Keywords】 glucocorticoid; cataract; catalase; superoxide dismutase; lactate dehydrogenase; transmission electron microscope。
【摘要】 目的：观察地塞米松诱导离体大鼠激素性白内障的形态学和酶活性变化，探讨激素性白内障发病机制. 方法：大鼠的100只透明晶状体随机分为对照组（DMEM）、地塞米松诱导的白内障组（DMEM＋地塞米松10 μmol/L），体外培养7 d，动态观察晶状体混浊情况，1,3,5和7 d分别从各组取12只晶状体，测定晶状体中的过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和乳酸脱氢酶（LDH）活性，7 d从各组取2只晶状体做透射电镜，观察晶状体形态学变化. 结果：7 d对照组晶状体呈雾状混浊，白内障组晶状体出现重度核混浊. 培养3 d，CAT,SOD,LDH活性分别下降约34.51%,7.78%,15.73%. 7 d活性分别比第1日下降约84.54%,30.17%,40.93%. 透射电镜观察对照组晶状体纤维细胞层次整齐，细胞膜、细胞连接、细胞器正常. 白内障组纤维细胞排列不齐，细胞间隙增大，线粒体出现空泡变性. 结论：地塞米松可诱导离体大鼠晶状体产生核性白内障，氧化应激可能参与激素性白内障的形成.
【关键词】 糖皮质激素；白内障；过氧化氢酶；超氧化物歧化酶；乳酸脱氢酶；透射电子显微镜。
0引言。
白内障是世界首位致盲性眼病，其发生与年龄、近视、糖尿病、长期应用糖皮质激素等多种危险因素有关. 自1960年Black等首次报道激素与白内障的关系以来，随着激素在器官移植、免疫性疾病、和战伤救治等治疗过程中的大量应用，激素性白内障越来越引起人们的重视［1］. 大量的流行病学资料证实长期大剂量全身、眼局部及吸入糖皮质激素治疗均可引起以晶状体后囊下混浊为特征的激素性白内障［2,3］. 而激素性白内障发病的确切机制尚未完全阐明，目前主要形成了氧化损伤学说、离子转运障碍学说、晶状体代谢紊乱学说、蛋白加和物学说、激素通过受体途径而发挥作用的受体学说［4］. 我们通过离体大鼠晶状体的培养，建立激素性白内障的离体模型，动态观测晶状体的混浊程度，利用透射电子显微镜观察激素性白内障晶状体的超微结构改变，测定晶状体中过氧化氢酶（CAT）,超氧化物歧化酶（SOD）及乳酸脱氢酶（LDH）活性的变化，探讨氧化损伤在激素性白内障中的作用.
1材料和方法。
1.1材料。
健康清洁级SD大鼠54只（第四军医大学实验动物中心提供），雌雄不限，鼠龄4 wk，体质量70~90 g. 地塞米松为美国Sigma公司产品，CAT,SOD,LDH测试盒购自南京建成生物工程研究所.
1.2方法。
1.2.1离体晶状体培养以颈椎脱臼法处死SD大鼠，取其眼球，剔除肌肉、筋膜等组织，安尔碘浸泡5 min，生理盐水冲洗3次，将眼球浸于DMEM液中，由后极部剪开巩膜，取出晶状体. 尽量去除晶状体表面的玻璃体. 将晶状体放入含5×104 u/L青霉素和5×104 u/L链霉素的DMEM培养基中，于37℃下，置50 mL/L CO2细胞培养箱中培养8 h后，弃去混浊晶状体，留取100只透明晶状体备用.
1.2.2激素性白内障模型的建立［5］将100只备用晶状体按随机数字大小等分为两组：正常对照组（A:DMEM），地塞米松诱导的激素性白内障组（B:DMEM+地塞米松10 μmol/L）. 分别放入含培养基的无菌24孔板中，于37℃下，置50 mL/L CO2细胞培养箱中培养，隔日换液. 培养中每日用解剖显微镜观察晶状体，记录晶状体混浊程度. 各组分别于第1,3,5,7日取出12只晶状体，称质量，—70℃冰箱冷冻保存.
1.2.3晶状体混浊程度的动态观察利用解剖显微镜，每日观察、记录晶状体混浊程度. 参考Mathur等［6］离体晶状体混浊的分级方法，将晶状体混浊程度分为0~5级，0级=透明晶状体，1级=晶状体呈雾状混浊，2级=晶状体皮质和核之间出现可见分界，3级=轻度晶状体核混浊，4级=重度晶状体核混浊，5级=晶状体完全混浊（Fig 1）.
1.2.4酶活性测定分别于第1,3,5,7日，从各组中取12只晶状体，按50 g/L (W/V)的量加入冷生理盐水，用匀浆机Heidolph DIAX900粉碎，3000 r/min离心15 min，取上清测定CAT, SOD和LDH活性，实验中严格按测试盒说明的实验步骤操作.
1.2.5电镜检查各取两组培养7 d的晶状体2只，放入40 g/L戊二醛固定液中固定24 h，用磷酸盐缓冲液冲洗，以10 g/L锇酸固定1 h，乙醇丙酮系列梯度脱水，环氧树脂812包埋、聚合，LKB型超薄切片机切片，铅铀双重染色，透射电子显微镜JEM100SX下观察超微结构.统计学处理：使用SPSS 12.0统计软件，对等级资料采用Wilcoxon秩和检验，定量资料采用析因设计方差分析进行不同时间及组间比较.
2结果。
2.1晶状体混浊情况的动态观察随作用时间延长，实验组大鼠晶状体的混浊程度逐渐加重. 培养1 d，白内障组显微镜下见部分晶状体呈雾状混浊， 2 d部分晶状体皮质和核之间出现可见分界，大多晶状体呈雾状混浊， 3 d出现轻度晶状体核混浊，6 d出现重度晶状体核混浊，7 d有晶状体完全混浊. 对照组，晶状体可保持4 d完全透明，4 d开始有少量晶状体出现雾状混浊，6 d少量晶状体皮质和核之间出现可见分界（Fig 1）.