从NO、ET角度探讨丹参素抗急性重型肝损伤的机制

作者：周鑫，韩德五，尹镭，赵海珍。

【摘要】 目的 从血管活性物质一氧化氮（NO）、内皮素（ET）探讨丹参素(DSS)抗急性重型肝损伤的机制。方法 用硫代乙酰胺(TAA)构建急性重型肝损伤大鼠模型。26只雄性Wistar大鼠分为3组：正常对照组(N组)，TAA组，TAA+DSS组。采用生化检测方法、免疫组化染色法和光镜技术，检测实验各组血浆内毒素、丙氨酸转氨酶(ALT)、NO和ET水平的变化、结构型一氧化氮合酶（eNOS）和诱生型一氧化氮合酶（iNOS）在肝组织中的表达变化及肝组织形态学改变。结果 TAA组血浆内毒素、ALT、NO、ET水平明显高于N组(P0.05)；TAA+DSS组与TAA组相比，内毒素、ALT、NO和ET显著降低(P0.05)。免疫组化染色TAA+DSS组iNOS表达较TAA组明显减少（P0.05）；TAA+DSS组与N组比较eNOS表达明显增多（P0.01）。Weigert染色显示TAA组微血栓计数明显增加，TAA+DSS组较前明显减少（P0.01）。结论 丹参素通过降低ET含量，上调eNOS表达、下调iNOS的表达调节NO含量，改善肝脏微循环障碍，从而减轻急性重型肝损伤。 【关键词】 肝损伤；丹参素；微循环；一氧化氮；内皮素 【Abstract】 Objective To explore protective effects of Danshensu(DSS) in severe hepatic injury rats and its mechanism relating to endothelin and nitric oxide. Methods Acute liver injury was induced by intragastric thioacetamide(TAA). The rats were randomly divided into 3 groups， namely：normal control group(N)， TAA treated group(TAA)， TAA and DSS treated group(TAA+DSS). The changes of plasma biochemistry and immunohistochemistry and hepatic histopathology were measured．Results The levels of ALT、endotoxin、NO and ET in TAA+DSS group significantly decreased(vs TAA group， P0.05).Immunohistochemical staining showed： eNOS expressial up regulation in TAA+DSS group compared with N group (P0.05)； nevertheless iNOS expressial up regulation in TAA group compared with TAA+DSS group (P0.05). Weigert’s staining showed microthrombi in TAA+DSS group significantly reduced (vs TAA group，P＞0.05).Conclusion Danshensu protect the severe hepatic injury by the decreasing of the value of ET and the up regulation of the hepatic eNOS expression and down regulation of the hepatic iNOS expression， the improvement of hepatic microcirculation. 【Key words】 liver injury；danshensu；microcirculation；nitric oxide；endothelin 丹参为唇形科植物丹参的根，是传统的活血化瘀中药之一。丹参素—D（+）β—（3，4—二羟基苯基）乳酸［1］是丹参水溶性各种成分的基本结构成分，已被证明有抗氧化、抗纤维化等作用［2，3］，但其对急性重型肝损伤有否作用，其机制如何尚鲜见报道。为此，笔者从血管活性物质一氧化氮、内皮素的角度探讨丹参素对肝脏微循环的影响，以观察其抗急性重型肝损伤的机制，为临床应用提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 模型制作及分组 采用灌胃硫代乙酰胺（TAA）的方法复制急性重型肝损伤动物模型。Wistar大鼠硫代乙酰胺（TAA）250mg/kg灌胃，连续2天，第2次灌胃24h后造成急性重型肝损伤。将Wistar大鼠26只随机分为3组：正常对照组（N组）；急性肝损伤组（TAA组）；急性肝损伤+丹参素灌胃组（TAA+DSS组）。TAA+DSS组给予丹参素（本校药学院赵正保教授提供）7.2mg/kg连续灌胃4天，实验第3天起，除正常组按250mg/(kg·d)给动物生理盐水灌胃外，其余2组按250mg/(kg·d)给动物TAA灌胃，连续2天。所有动物于末次灌胃TAA 24h后，用1%戊巴比妥钠0.33ml/100g腹腔内注射麻醉，在无菌条件下腹主动脉采血，用于生化指标检测。取1/2肝左叶于10%中性福尔马林中固定，石蜡包埋，切片，做Weigert染色和免疫组化染色；1/2肝右叶分别用生理盐水制成10%、20%肝匀浆进行ET和NO的检测。 1.2 生化指标检测 1.2.1 丙氨酸转氨酶（ALT）含量测定 采用改良赖氏法。 1.2.2 血浆内毒素（Endotoxin）测定 鲎试剂法，试剂盒购自上海伊华临床医学科技公司。 1.2.3 肝组织匀浆ET水平检测 采用放免法，在SN—695A型智能放免γ测量仪进行测定，试剂盒购自北京解放军总医院科技开发中心放免所。 1.2.4 肝组织匀浆中NO含量测定 硝酸还原酶法，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。 1.3 病理组织学观察 Weigert改良革兰特殊染色：取大鼠肝左叶固定于纯酒精中，石蜡包埋，4μm切片，做光镜观察，镜下可见经Weigert改良法特染的血管内微血栓呈紫蓝色丝状团块物，每组各取5张切片，每张切片各随机取5个非重叠视野，光镜下(×200)进行微血栓的计数。 1.4 iNOS和eNOS免疫组化染色 采用SP法，切片脱蜡水化，3%H2O2处理15min，胰酶消化10min，热抗原修复10min，山羊血清封闭，分别滴加1：200eNOS一抗和1：100iNOS一抗（eNOS及iNOS多克隆抗体均由美国Santa Cruz公司提供），4℃过夜，滴加二抗（中山生物技术有限公司）37℃孵育10min，DAB显色，阴性对照以PBS代替一抗。采用Olympus—BH2显微系统摄像，成都泰盟BI2000医学图像分析系统测定阳性细胞所占的面积。 1.5 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件进行处理，采用方差分析、t检验，所有数据均以均数±标准差（x±s）表示。 2 结果 2.1 血浆ALT及内毒素水平变化 TAA组与N组相比，ALT及内毒素水平显著升高（P0.01）；TAA+DSS组与TAA组相比，上述指标明显下降（P0.01），见表1。

表1 各组动物血浆ALT及内毒素水平变化 (x±s)。

注：a. vs N组，b. vs TAA组，*P0.01 2.2 肝组织匀浆ET和NO的变化 TAA组与N组相比，ET、NO均明显升高；TAA+DSS组与TAA组相比，ET、NO均明显下降，见表2。

表2 肝组织匀浆ET、NO的变化 (x±s)。

注：a. vs N组， b. vs TAA组，△P0.05，*P0.01。