四种纯化弓形虫速殖子方法对虫体RNA影响的比较

作者：杨秋林，许丽芳，伍和平。

【摘要】 目的 比较纯化弓形虫速殖子的四种方法对虫体RNA的影响。方法 以2.0×105个速殖子腹腔接种于昆明小鼠，72h后收集小鼠腹腔液，以胰蛋白酶消化法、微孔滤膜过滤法、G3滤斗和CF—11纤维素柱法纯化弓形虫速殖子，用AGPC法抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳检测总RNA。结果 胰蛋白酶消化法虫体回收率最大，但时间长，易造成RNA降解；微孔滤膜过滤法回收率低；G3滤斗纯度不高；CF—11纤维素柱法快速简单、纯度高，对RNA无影响。结论 微孔滤膜过滤法、CF—11纤维素柱法对虫体RNA的影响小，较适用于cDNA文库构建时虫体的分离纯化。

【关键词】 弓形虫，病；胰蛋白酶消化法；微孔滤膜过滤法；G3滤斗；CF—11纤维素柱法。

为构建高质量的cDNA文库及在其它的一些研究中，必须在尽可能短的时间里从感染弓形虫的小鼠腹水中去除炎性细胞、腹腔细胞和红细胞，纯化弓形虫速殖子，以减少mRNA的降解。为此我们比较了四种不同的纯化方法对虫体RNA的影响，以期尽可能快地获得较纯的弓形虫速殖子，提取高质量的mRNA。

1 材料与方法。

1.1 材料。

1.1.1 弓形虫虫株 弓形虫昆山分离株由江苏省寄生虫病研究所王崇功教授赠送。

1.1.2 试剂 胰蛋白酶购自华美公司，微孔滤膜（直径3μm）、G3滤斗购自上海医药工业研究院。CF—11纤维素购自Whatman公司；其余试剂为国产分析纯。

1.2 方法。

1.2.1 虫体的收集 以2.0×105个速殖子腹腔接种于昆明小鼠，72h后收集小鼠腹水，3000r/min离心8min，弃上清。

1.2.2 胰蛋白酶消化法 虫体中加入20倍量压积的0.25%～0.3%胰蛋白酶消化液，37℃消化30 min，PBS洗两次，沉淀如上法重复消化洗涤一次。镜检记数。

1.2.3 微孔滤膜过滤法 虫体中加适量PBS制备虫体悬液，过内装直径3μm 微孔滤膜的滤器，收集滤出液，离心。镜检记数。

1.2.4 G3滤斗 虫体悬液过G3滤斗，收集滤出液，离心，镜检。

1.2.5 CF—11纤维素 CF—11纤维素在PBS中4℃过夜，弃浮在上面的细颗粒，装柱约3cm高。加虫体悬液10ml，20ml PBS洗柱，收集滤出液，离心，镜检记数。

1.2.6 弓形虫速殖子总RNA的抽提 分别以AGPC法抽提以上四种方法纯化的虫体总RNA［1］，75%乙醇洗涤总RNA沉淀三次后空气干燥10min，最后将总RNA沉淀溶于DEPC处理过的ddH2O中，用甲醛变性胶电泳检测总RNA［2］。