PCR和DNP标记核酸探针检测禽源沙门氏菌四环素耐药性基因tetC的研
【摘要】 目的 观察利用PCR和DNP标记核酸探针检测禽源沙门氏菌四环素耐药性基因tetC。方法 通过对临床分离并经生化实验和血清学试验鉴定的11株禽源沙门氏菌和1株标准株C79—13进行药敏试验。结果 有11株有高耐药性，另外1株有低耐药性，耐药率达100%；对其四环素耐药基因tetC进行了扩增，结果获得以质粒为模板的特异性产物，与药敏试验符合率为100%；用DNP标记其PCR产物，制成DNA探针，采用菌落杂交方法对12株沙门氏菌菌落进行杂交。结果显示：与PCR结果的阳性符合率为90.2%，具有很高的特异性。结论 利用PCR和用DNP标记的这种探针检测四环素耐药基因tetC具有很高的敏感性和特异性，从而为禽类沙门氏菌的耐药性检测提供了高效敏感的手段。
【关键词】 沙门氏菌；四环素耐药基因；TetC； PCR；核酸探针。
Study on detection of tetracycline resistance gene(tetC) of avian pathogenic Salmonella by PCR and DNP labeled nucleic acid probe。
【Abstract】 Objective By using clinical isolates and biochemical and serologic tests detection on 11 avian Salmonella strains and one standard Salmonella C19—13, the drug—susceptibility test shows that: 11 strains are with high resistance, another 1 is low.Methods Results The drug—susceptibility tests also shows that the rate is 100%. After amplifying the tetracycline—resistance gene, it produces specific material by plasmids complete and the concordance rate to drug—susceptibility test is 100%. By using the method of probing the tetC gene labeled with DNP and use colony hybridization to 12 strains, the method of PRC showed 90.2% concordance in positive rate and with high speciality. Conclusion The result indicates that the probe of tetC gene with PCR to detect tetracycline—resistant gene has the character of susceptibility and speciality. The paper will provides effective and exact methods to detect the drug—resistance of avian Salmonella.
【Key words】 Salmonella; tetracycline—resistant gene; tetC; PCR; nucleic acid probe。
饲料中添加四环素类药物和临床上大量滥用四环素类药物，被认为是引起病原菌的耐药性大量产生的原因［1］。四环素类药物早在20世纪60～70年代就已广泛应用，尤其在兽医的临床上更是如此，所以导致细菌对四环素类的耐药性颇为严重，我国的情况更是如此。抗生素的选择性压力、外源性耐药质粒的获得、耐药质粒及转座子在肠道菌间的传递等是耐药菌株产生和不断增多的主要原因，四环素耐药性的产生常常是由于获得了有关接合质粒或转座子中新的四环素耐药基因tet。另外， 沙门氏菌还可以感染人和其他动物，耐药性的研究，是关系到兽医、食品卫生和人类健康的严肃的问题，绝不能掉以轻心。本文就禽源沙门氏菌的耐药质粒的四环素耐药基因tetC 进行了分子生物学水平诊断方面的研究。
1 材料与方法。
1.1 材料。
1.1.1 菌株 沙门氏菌标准株：C79—13(购自中国兽药监察所),药敏质控菌ATCC25922(购自生物制品监察所)，临床上经分离培养并经细菌学和生化及血清学鉴定的禽源沙门氏菌11株(西南民族大学生命科学与技术学院禽病研究所分离)。
1.1.2 培养基及常规化学药品和试剂 四环素、金霉素、土霉素、强力霉素药敏纸片(购自北京天坛药物生物技术开发公司)；四硫磺酸钠煌绿增菌培养基、亚硒酸盐胱氨酸增菌培养基、SS培养基、三糖铁琼脂培养基、LB培养基(由国产试剂自配)；肠杆菌科细菌生化编码鉴定管（购自杭州天和微生物试剂有限公司）、沙门氏菌属诊断血清试剂盒（购自成都生物制品研究所）。
1.1.3 分子生物学试剂和用品 100bp DNA Marker、PBR322、PUC18、Taq PCR试剂盒（购自天为时代科技有限公司）；Biospin胶回收试剂盒（购自Bioer Technology有限公司）；带正电尼龙膜、硝酸纤维膜、杂交袋或杂交瓶、紫外交联仪（购自华美公司）；暴光盒（购自粤华公司）；胶片（购自柯达公司）；鲑鱼精DNA、电泳级琼脂糖（购自宝生物工程有限公司）；质粒小提量试剂盒（购自OMEGA生物科技公司）；TAE自配；HybQUESTComplete System(购自美国Mirus生物公司)；X—ray光机(上海讯星电子科技公司)。
1.2 方法。
1.2.1 病原菌的临床分离和鉴定 对于临床上的疑似沙门氏菌病例，经无菌接种和四硫磺酸钠煌绿培养基增菌培养以及SS培养和三糖铁培养，再经生化和血清学鉴定以确定沙门氏菌。具体方法见试剂盒说明书和参考文献［1］。
1.2.2 药敏试验 以大肠杆菌ATCC25922做药敏质控菌,采用琼脂平板稀释分别测定禽原沙门氏菌对四环素、土霉素、金霉素和强力霉素的MIC值。具体参考文献参见［1］。
1.2.3 tetC基因的PCR 引物设计：根据Genebank中注册的tetC的序列，用DNA Man软件处理后，提交序列给大连宝生物公司，再用OLIGO6.0软件设计四环素抗性基因TetC的引物。
LEFT PRIMER22 59.86 45.45 4.00 1.00 agattgtcacgaccacatcatc。
RIGHT PRIMER 22 60.16 45.45 3.00 0.00 actttctaaggcagaccaacca。
模板制备:用小提量的质粒提取试剂盒(美国进口试剂盒，由天泰公司提供)，步骤按说明书上的方法进行，但需要优化步骤。模板稀释10倍。
对照：以PBR322为阳性对照，以PUC18作为阴性对照。50μl反应体系：(1)模板DNA 1μl;(2)LEFT PRIMER 1μl、RIGHT PRIMER 1μl(贮存液稀释10倍);(3)10×Taq buffer 5μl;(4)dNTP mixture 4μl;(5)MgCl2 4μl;(6)Taq 1μl;(7)ddH2O 34μl。
反应条件：Step1 94℃ 3min： Step2 94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1min，35个循环：Step3 72℃ 5min。
1.2.4 tetC基因的序列分析 试剂回收后，送大连宝生物公司测序，再与Genebank中注册的PBR322中的TetC基因序列在DNA Man软件进行比对，分析其同源性。
1.2.5 DNP标记核酸探针 经纯化和回收的PCR产物经DNP标记，制备成核酸探针。
标记反应体系(20μl)：(1)Diluted Sample DNA(14μl);(2)10×Labeling Buffer A(2μl);(3)Label ITReagent(4μl)。
对照标记反应体系(20μl)：(1)Control DNA(8μl);(2)无核酶水(6μl);(3)10×Labeling Buffer A(2μl);(4)Label ITReagent(4μl)。
制法：稀释2μl的Sample DNA至14μl，加它到盛有Label ITReagent的小瓶内，再加入2μl的10×Labeling Buffer A，轻轻摇匀，37℃孵化1h后，利用乙醇沉淀法或使用G50微螺旋纯化柱，从已标记的DNA中除去未反应的Label ITReagent，然后储存在—20℃冰箱中备用。具体操作见文献［2,3］以及标记试剂盒说明并经优化处理。
1.2.6 细菌菌落转移 在琼脂平皿上(含有四环素的营养培养基)接种细菌,经培养后获得所需要的大量的细菌克隆。准备一些带正电的尼龙膜，灭菌之后，把膜放在琼脂平面上转移细菌克隆到新的含有四环素的琼脂平面上培养，孵育几个小时(37℃)，然后经细胞裂解、DNA变性和固定后，为杂交做好准备，具体操作见文献［2,3］以及标记试剂盒说明并经优化处理。