三七总皂甙诱导脐血单个核细胞分化为内皮细胞

【摘要】 为了研究三七总皂甙(total panax notoginseng saponins, tPNS)对脐血单个核细胞诱导出内皮细胞的影响,采用含三七总皂甙的DMEM对脐血单个核细胞进行诱导，用光学显微镜和荧光显微镜观察细胞形态，流式细胞术检测细胞表面标记UEA1、功能标志vWF及CD31的变化。结果显示： 250 mg/L tPNS组诱导所得的贴壁细胞数及结合UEA1的阳性率均多于其它浓度的三七总皂甙组（P0.05）。50 ng/ml VEGF+250 mg/L tPNS组表达CD31和结合UEA1阳性的贴壁细胞数与50 ng/ml VEGF组相比较，无明显的差异(P0.05)。结论：中药三七总皂甙可以诱导脐血部分单个核细胞分化为内皮细胞；合用三七总皂甙和VEGF无协同诱导作用。

【关键词】 三七总皂甙 脐血 单个核细胞 内皮细胞。

Effect of Total Panax Notoginseng Saponins on Inducing Differentiation of Mononuclear Cells in Human Cord Blood into Endothelial Cells。

Abstract To investigate the effect of total panax notoginseng saponins （tPNS） to induce the differentiation of mononuclear cells (MNC) in cord blood into endothelial cells， the DMEM culture media containing tPNS were used to induce the MNC of cord blood. Then, the morphology of the adherent cells was observed by the light microscopy and the fluorescence microscopy, the changes of cell surface markers (UEA1), function marker (vWF) and CD31 were detected by flow cytometry. The results showed that the number of adherent cells produced by 250 mg/L tPNS and the positive rate of cells expressing CD31 and UEA1 were higher than those in the groups of other concentrations（P0.05）. There was no significant difference in the number of adherent cells expressing CD31 and UEA1 between 50 ng/ml VEGF+250 mg/L tPNS and 50 ng/ml VEGF. It is concluded that the traditional Chinese drug tPNS can induce partial MNC in the cord blood to differentiate into endothelial cells. No synergistic effect has been found between tPNS and VEGF.

Key words total panax notoginseng saponins; cord blood; mononuclear cell; endothelial cell。

三七总皂甙（total panax notoginseng saponins, tPNS）是我国中药田三七的主要药用成分，主要含人参二醇型皂甙Rb1、人参三醇型皂甙Rg1和生物碱等成分，能特异性地阻断受体操纵性的钙离子通道，具有扩张血管、降低心脏后负荷、减少心肌耗氧量和心律失常的作用，常用于治疗中风、脑缺血等疾病［1］，还可使心肌缺血区面积明显缩小［2］。微循环的改善与内皮细胞的形成和功能密切相关，内皮细胞的生成是血管新生的基础，在机体病理生理过程中具有重要作用。本实验通过使用tPNS诱导脐血部分单个核细胞分化为内皮细胞，探讨tPNS对内皮细胞形成的作用。

材料和方法。

材料和试剂。

脐血来源于本院妇产科健康足月妊娠产妇（顺产）脐带血，肝素抗凝。tPNS购自北京生物制品检定所，内皮细胞黏附因子购自Cascade Biologics公司，FITC标记的Ⅰ型荆豆凝集素（Ulex europaeus agglutinin1， UEA1）购自Sigma公司，FITC标记的抗人CD31单克隆抗体购自eBioscience公司， FITC标记的抗人vWF单克隆抗体购自Becton Dickinson Biosciences公司，淋巴细胞分离液购自HY Bio 公司，DMEM购自Gibco公司，胎牛血清购自北京元亨圣马生物研究所， Epics XL型流式细胞仪为美国Coulter公司产品。

用Ficoll淋巴细胞分离液（比重1.077）分离脐血单个核细胞并培养于含有10%胎牛血清，100 U/ml的青霉素，100 U/ml链霉素的DMEM中，调整细胞数至1×106/ml置入培养瓶中，在含37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养24小时。

培养24小时前、后单个核细胞UEA1和CD31阳性率的测定。

取分离出的脐血单个核细胞悬液(1×106/ml)100 μl，分别加入UEA1FITC、CD31FITC 各20 μl，室温避光孵育30分钟，再用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞2次，加1 ml PBS重悬细胞，立即在流式细胞仪上检测UEA1和CD31阳性率。取培养24小时后未贴壁的细胞悬液，按上述方法制备，检测UEA1和CD31阳性率，同培养前进行比较。

不同浓度tPNS诱导脐血单个核细胞分化为内皮细胞的检测。

在24孔培养板各孔中加入0.1%内皮细胞黏附因子0.5 ml，37℃静置30分钟，待培养板底部形成明胶膜后吸弃上清液。将培养24小时后未贴壁的脐血单个核细胞进行细胞计数，调整细胞浓度至（1—2）×106/ml，每孔加入0.5 ml细胞悬液，接种于培养板中，然后分别加入终浓度为0、125、250、500、1 000、2 000 mg/L的含tPNS的DMEM，每个浓度取4个平行孔，重复5次。培养72小时后，各组均换成不含tPNS的DMEM，每48小时半量换液，培养至第7天，倒置显微镜下观察每孔细胞的形态。弃去培养液，用 PBS液洗3次，再用0.25%胰蛋白酶消化后洗下贴壁细胞进行细胞计数。

贴壁细胞结合UEA1阳性率的流式细胞术检测。

培养至第7天吸弃悬浮细胞，将各组培养所得贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化，离心，洗涤，用流式细胞仪检测并比较各组贴壁细胞结合UEA1的阳性率。

贴壁细胞的表面标记及形态鉴定。

以tPNS终浓度为250 mg/L的DMEM诱导脐血单个核细胞，培养至第7天将部分贴壁细胞洗下行流式细胞仪检测（结合UEA1阳性率，表达CD31阳性率，表达vWF阳性率）。部分细胞培养至第14天，倒置显微镜下观察并拍照，吸弃培养液，用PBS液洗涤后加入UEA1FITC，置于荧光显微镜下观察并拍照，发绿色荧光的细胞为阳性细胞。

tPNS、VEGF及两者联合体外诱导脐血单个核细胞分化为内皮细胞的检测。

将脐血单个核细胞中未贴壁细胞进行细胞计数，调整细胞浓度至（1—2）×106/ml，每孔加入0.5 ml细胞悬液，接种于含明胶膜的24孔培养板中，然后分别加入终浓度为250 mg/L tPNS、50 ng/ml VEGF、250 mg/L tPNS+50 ng/ml VEGF和空白DMEM。培养72小时，各组均换成DMEM，培养至第7天，行贴壁细胞计数，并用流式细胞仪检测结合UEA1和表达CD31的阳性率。用贴壁细胞数乘以结合UEA1阳性率和表达CD31阳性率即为所得阳性贴壁细胞数。重复5次，进行组间比较。

统计学分析。

数据应用均数±标准差（±SD）表示，各实验组均数间多重比较采用LSDt检验（方差齐）或Dunnett T3检验（方差不齐时）。P0.05为差异有显著性。

结 果。

培养前后脐血单个核细胞结合UEA1和表达CD31阳性率变化。

分离后即刻检测脐血单个核细胞结合UEA1阳性率为45.1%，表达CD31阳性率为24.0%。培养24小时未贴壁细胞结合UEA1阳性率为4.4%，表达CD31阳性率为12.0%。