重组孕激素受体基因酵母法对南山茶子拮抗孕激素作用的研究
作者：吴小娟，李剑，刘芸，李娜 ，唐玲，冯宝民，王永奇。
【摘要】 目的研究南山茶子拮抗孕激素作用。方法用系统溶剂分离法将南山茶子醇提物分成极性不同的组分，利用重组人孕激素受体基因酵母生物检测法筛选南山茶子拮抗孕激素活性部位。结果5个组分都表现出拮抗孕激素的效应，活性强弱依次为醋酸乙酯层正丁醇层石油醚层水层醇提物。结论醋酸乙酯部位可能为南山茶子拮抗孕激素的活性部位。
Abstract：ObjectiveTo study the antiprogestin active parts of the seeds of Camellia serrdserrate Chi.MethodsThe seeds of Camellia serrdserrate Chi. extract was separated into four fractions according to polarity, its antiprogestin active parts was investigated by a recombinant yeast screening assay. ResultsThe five fractions showed antiprogestin activity, and the order of the estrogenic activity of these fractions was ethyl acetate normal butyl alcohol petroleum ether water extract alcohol extraction.ConclusionThe ethyl acetate is the antiprogestin active parts of the seeds of Camellia serrdserrate Chi..
Key words：Camellia serrdserrate Chi.; Recombinant yeast; Progesterone receptor; Antagonistic effect。
正常人骨代谢的平衡是离不开体内一种特殊物质调节的，这种特殊物质就是激素。激素是由内分泌器官所分泌的一种高效能有机化合物，人体内很多种激素，其中目前已经明确与骨质疏松有关联的8种：雌激素、甲状腺激素（PTH）、降钙素、活性维生素D、甲状腺激素、雄激素、皮质类固醇激素、生长激素。其中前4种更为重要。这些激素或通过影响破骨细胞的数量及活性来调节骨吸收过程，或通过影响成骨细胞的活性来调节骨形成过程，从而调节骨代谢。当这些激素在人体内达到某一浓度时能够维持骨吸收与骨形成的平衡，但当它们在体内的含量发生异常变化时，便会使骨代谢失去平衡，导致骨量的减少，从而引起骨质疏松。已有大量的文献报道［1，2］：孕激素受体能够降低雌激素受体(ER)的转录活性，也就是说对孕激素受体活性的抑制能够增强体内雌激素受体活性的表达。
南山茶Camellia serrdserrate Chi.属于山茶科山茶属植物，广泛分布于我国的西南部和东南部，集中分布于我国长江以南的亚热带地区，资源非常丰富［3］，其化学成分主要有黄酮，皂苷和多酚这三大类［4］，我们在对山茶属植物药用价值的研究过程中发现，南山茶种子乙醇提取物对维甲酸所致骨质疏松的大鼠有很强的抗骨质疏松活性，并且明显高于阳性对照药。为了具体确定南山茶子抗骨质疏松的有效部位，我们首先用95%乙醇提取南山茶子得到醇提物，对其中三类化学成分的含量进行了测定，总黄酮4.07%，总皂苷12.15%，总酚4.30%［5］，并分别依次用石油醚、醋酸乙酯、水饱和正丁醇进行萃取，浓缩至干，再用转基因酵母的生物检测方法对它们是否有拮抗孕激素受体的作用进行研究，从而从另一角度来阐明南山茶子抗骨质疏松的作用机理。
1 仪器与试药。
Laborata 4000型旋转蒸发仪（Heidolph，Germany）；酶标仪（Spectra Fluor plus，TECAN，Austria）；分光光度计（WFZ UV—2000，上海）；恒温振荡摇床（HZQ—F，哈东联）；恒温平板摇床（Titramax 1000，Heidolph，Germany）；百级超净工作台（DL—CJ—1F，哈东联）,旋涡混合器（MS2，广州IKA Works），96孔培养板，96孔酶标板（比利时 Orange）。ONPG（Sigma，USA），二甲基亚砜（99.9%，Sigma，USA），酵母氮碱（Difco，USA）。
南山茶种子（2006年3月采集于广西省平南县六陈镇，经昆明植物民裴盛基教授鉴定）；重组人孕激素受体（hPR）基因酵母（Gaido赠送）；SC培养基；孕酮（PG）（MP. Bio medical公司）；酶反应底物邻硝基苯基β－D－半乳糖苷（Sigma）；二甲基亚枫(Sigma)，所用试剂均为分析纯，溶于超纯水（Milli—Q，USA）。
2 方法。
2.1 试剂的配制。
2.1.1 SC培养液称取36 mg赖氨酸，12 mg组氨酸，6.7 g无氨基酵母氮源，20 g葡萄糖溶于1 000 ml超纯水中，用0.22 μm滤膜过滤除菌后于4℃下冷藏保存。
2.1.2 基础缓冲液称取21.5 g Na2HPO4·12 H2O，6.22 g NaH2PO4·2H2O，0.75 g KCl，0.25 g MgSO4·7H2O溶于1 000 ml超纯水中，于4℃下冷藏保存。
2.1.3 邻硝基苯基β－D－半乳糖苷溶液（ONPG）溶液（13.3 mmol·L—1）称取0.4 g ONPG溶于100 ml基础缓冲液中即可（现配现用）。
2.1.4 Na2CO3溶液（1 mol·L—1）称取10.6 g无水Na2CO3溶于100 ml超纯水中，于4℃下冷藏保存。
2.1.5 CuSO4溶液（50 μmol·L—1）称取1.196 g CuSO4·5H2O溶于100 ml超纯水中，于4℃下冷藏保存。
2.2 酵母接种的培养重组人孕激素受体基因酵母由Gaido赠送，培养基为增加硫酸铜（50 μmol·L—1）、腺嘌啉、赖氨酸、色氨酸的SC培养基，室温避光保存［6］。