5负载U266细胞抗原的树突状细胞诱导T细胞的抗骨髓瘤活性

【摘要】 　　本研究探讨负载骨髓瘤U266细胞裂解物的树突状细胞（DC）瘤苗活化的T细胞对U266细胞的体外杀伤作用。用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，然后分别用含重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、重组人白细胞介素4（IL4）的AIMV无血清培养液和含胎牛血清的RPMI 1640培养液体外诱导培养DC，用MTT法检测负载U266细胞全抗原的DC活化的T细胞对U266细胞的杀伤作用。结果表明：健康人外周血来源的单个核细胞用无血清培养液和含血清培养液诱导培养均可得到足够数量的DC，这两种培养液培养的DC在表型上无明显差异。分别用负载U266细胞全抗原的DC＋IL2、成熟DC＋IL2和单独应用IL2刺激后的T细胞与U266细胞共培养，其对U266细胞的杀伤作用逐渐减弱，负载U266细胞全抗原的DC＋IL2刺激后的T细胞较成熟DC＋IL2刺激后的T细胞对U266细胞的杀伤作用明显，且T细胞对U266细胞的杀伤率随效靶比的增加而升高。结论：用GMCSF、IL4诱导培养健康人外周血单个核细胞可以得到不成熟的DC，体外负载U266细胞全抗原的DC可以刺激自体T细胞增殖并能杀伤U266细胞。

【关键词】 多发性骨髓瘤； 树突状细胞； 免疫治疗。

Antimyloma Activity of T cell Activated by Dentritic Cells Loading Antigen of U266 Cells。

Abstract This study was aimed to investigate the effect of T cells activated by DCs loaded with whole antigens of U266 cells on the U266 cells survival in vitro. Peripheral blood mononuclear cells were isolated from healthy donor, and adherented on culture plate. Adherent cells were cultured in AIMV serumfree medium or in RPMI 1640 medium contained 20% fetal bovine serum (FBS), supplemented with granulocytemacrophage colony stimulating factor (GMCSF) and interleukin4 (IL4). Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay was used to evaluate killing rate of U266 cells by T cells activated by DCs loaded with whole antigen of U266 cells. The results showed that DCs derived from peripheral blood mononuclear cells cultured by AIMV serumfree medium or RPMI 1640 medium containing FBS had similar immunophenotype. T cells activated by DCs loaded with whole antigen of U266 cells or mature DCs might kill U266 cells in a dosedependent manner. It is concluded, DCs derived from peripheral blood mononuclear cells of healthy donor and loaded with whole antigen of U266 cells can induce antimyeloma response of T cells in vitro.

Key words multiple myeloma; dendritic cell; immunotherapy。

J Exp Hematol 2007; 15(3):581—585。

树突状细胞（DC）是体内功能最强的抗原呈递细胞(APC)，存在于除脑组织外的所有组织器官中，是机体免疫反应的始动者，其表达丰富而独特的免疫球蛋白分子而发挥免疫佐剂的作用。DC表面的免疫球蛋白不仅可以聚集免疫细胞，而且有利于免疫细胞间的信息传递；DC受抗原性物质刺激后能够分泌多种细胞因子，诱导特异性的免疫反应。肿瘤免疫逃避的机制之一是抗原呈递细胞的数量不足或功能下降，而肿瘤细胞的清除要依靠宿主抗原呈递细胞的强有力的功能。DC作为最强的唯一能激活初始T细胞的抗原呈递细胞，在治疗肿瘤和预防肿瘤发生、复发及转移中发挥重要作用。

目前针对多发性骨髓瘤的治疗主要采用化疗和造血干细胞移植等综合治疗，取得了一定的效果，但微小残留病灶的存在使骨髓瘤易复发，患者生存期缩短。以DC为基础的免疫治疗是近几年来清除骨髓瘤微小残留病研究的热点。国外报道用无血清培养液诱导培养骨髓或外周血单个核细胞来源的DC，然后用凋亡的骨髓瘤细胞或骨髓瘤细胞分泌的单克隆免疫球蛋白(Ig)，即M蛋白负载DC，使其捕获、加工并表达肿瘤抗原而得到DC瘤苗，再通过静脉或皮下注射的方式回输体内，可以观察到骨髓瘤特异的抗瘤效应［1，2］。国内这方面的研究较少。本实验体外诱导培养健康人外周血来源的DC，使其负载骨髓瘤细胞系U266细胞全抗原，探讨负载抗原的DC对淋巴细胞的活化作用，及活化的淋巴细胞对U266细胞的杀伤活性。

主要试剂。

U266细胞系来自本试验室，AIMV无血清培养液、RPMI 1640细胞培养液、胎牛血清（FBS）均购自Gibco公司；淋巴细胞分离液（1.077 g/ml）、MTT购自Sigma公司；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGMGSF）、重组人白细胞介素4（rhIL4）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素2（IL2）均购自Sigma公司；荧光标记的鼠抗人单克隆抗体CD1αFITC，CD14FITC，CD80FITC，CD86PE，CD83FITC，HLADRPE均购于美国Becton Dickinson公司。

DC的培养、收集及鉴定。

参照Wen等［3］诱导培养外周血来源DCs的方法并加以改进。取10例健康人抗凝外周血40 ml，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMNC）；用RPMI 1640洗涤并重悬PBMNC，调整细胞浓度为2×106/ml，加于6孔培养板中，每孔2 ml，放置于37℃、5% CO2，相对湿度95%培养箱中孵育2小时后，收集非贴壁细胞（淋巴细胞）作为效应细胞。取少量细胞，用流式细胞仪检测T细胞含量，其余细胞冻存。贴壁细胞继续培养,分别加入AIMV无血清培养液和含20% FBS的RPMI 1640培养液，两种培养液中均加入rhGMCSF 100 ng/ml、rhIL4 50 ng/ml，放置于37℃、5% CO2培养箱中孵育，每3天半量换液并补充细胞因子，6天后收集悬浮和吹吸下来的轻微黏附细胞即为不成熟DC。取部分细胞做细胞表型检测，在部分细胞培养孔中加入TNFα 10 ng/ml诱导DC成熟，继续培养48小时后收集细胞做表型检测。

U266细胞全抗原的制备。

将—80℃保存的U266细胞解冻后传代培养，取增殖旺盛的细胞用于实验。将细胞（5×105/ml）在液氮中反复冻融6次，此时经台盼蓝染色后显微镜观察细胞裂解率可达99%，然后600×g离心10分钟，上清液经孔径0.22 μm的滤过膜除菌后即为U266细胞裂解物，此裂解物含有U266细胞的全抗原。

U266细胞裂解液致敏对DC的致敏。

DC培养至第6天，部分培养孔中加入100 μl U266细胞裂解液和TNFα 10 ng/ml，放置于37℃、5%、相对湿度95%、CO2培养箱中孵育，使DC负载U266细胞全抗原。48小时后用PBS轻轻冲洗，收集悬浮细胞，即为U266细胞裂解液致敏的DC。

效应细胞的增殖。

复苏冻存的效应细胞（淋巴细胞），用台盼蓝染色判断细胞活性，活细胞拒染，用RPMI 1640培养液调整效应细胞浓度为2×106/ml，置于96孔板中，50 μl／well，按照不同的刺激物分为3组，每组设3个复孔。参考文献［4］，第1组加入IL2（30 ng/ml）；第2组加入IL2（30 ng/ml）和U266细胞裂解液致敏的DC（2×105/ml），第3组加入IL2（30 ng/ml）和成熟DC（2×105/ml），放置于37℃、5%、相对湿度95%、CO2培养箱中培养5天后，收集细胞并计数，以此细胞作为活化的效应细胞。

T细胞杀伤活性测定。

以U266细胞为靶细胞，传代培养，取生长旺盛的细胞用于实验。按照5∶1、10∶1、20∶1的效靶比（E∶T），在效应细胞（终浓度为2×106/ml，50 μl/well）孔内分别加入相应量的靶细胞。另设置靶细胞（细胞数同效应细胞孔）和效应细胞对照孔，每孔设3个复孔，所有孔的液体总量相同，不足的以RPMI 1640培养液调整，于37℃、5% CO2培养箱中孵育4—6小时，加入MTT溶液10 μl/well，继续培养4小时。加入MTT助溶剂DMSO 100 μl/well，充分溶解，静置5分钟。酶标仪以波长490 nm测OD值，以3孔均数值表示。按公式计算T淋巴细胞杀伤率。

杀伤率（%）=［靶对照组OD－（效靶组OD—效应。

对照组OD）／靶对照组OD］×100%。

统计学方法。

实验数据以(±SD）表示，应用SPSS 11.5统计学软件处理，P0.05为有统计学意义。

结 果。

树突状细胞的表型分析。

健康人外周血单个核细胞在含有rhGMCSF、rhIL4的AIMV无血清培养液和含有20% FBS的RPMI 1640培养液中培养，第3天均可以观察到部分细胞悬浮生长，并形成集落，呈圆形或类圆形，可见毛刺状突起，但大部分细胞仍贴壁生长，细胞周边有不规则突起；6天后加入TNFα，有更多的细胞悬浮生长。流式细胞仪分析两组培养液培养的DC表型，未加入TNFα之前,DC表达CD1α、CD80、CD86、HLADR，不表达CD14、CD83（表1），符合不成熟DC（imDC）的特点，并且两组培养液培养的imDC在细胞免疫表型表达上无明显统计学差异（P0.05）。

加入TNFα 48小时后，流式细胞仪分析两组培养液培养的DC表型，结果DC表达CD1α、CD80、CD86、CD83，不表达CD14、HLADR（表2），符合成熟DC（mDCs）的特点，并且两组培养液培养的成熟DC在细胞免疫表型表达上无明显统计学差异（P0.05）。