中药安迪注射剂对白血病K562细胞株增殖和凋亡的影响

【摘要】 目的： 探讨安迪（Adi）注射剂对人白血病K562细胞株增殖和凋亡的影响. 方法： MTT法测定K562在Adi 作用后的细胞活力(A值)；流式细胞技术检测细胞凋亡变化；电镜观察细胞的形态学改变等；综合评价Adi 对K562细胞株增殖和凋亡的影响. 结果： ① MTT法测得Adi 在(2.5～20.0) μg/mL浓度范围内能明显抑制K562细胞的增殖,并具有浓度依赖性, 20.0 μg/mL Adi 作用36 h的K562细胞株A值最低；② 流式细胞仪检测结果显示10.0，20.0 μg/mL Adi 处理组K562细胞的凋亡率分别为50%和39%，明显高于对照组的10%（P0.05）；③ 电镜下可见K562细胞呈典型凋亡样改变. 结论： Adi 能明显抑制K562细胞增殖，并具有显著促进细胞凋亡的作用.

【关键词】 安迪注射剂； 白血病，幼红细胞，急性；细胞增殖； 细胞凋亡。

中药具有十分重要的抗肿瘤作用，中药诱导肿瘤细胞凋亡也已成为近年来国内外研究的热点. 王四旺等［1—2］研制的安迪 (andi injection，Adi) 注射剂中的主要成分蟾酥，具有解毒、消肿、醒神、开窍、强心和止痛等作用，其化学成分含有蟾毒灵(bufalin，BL)，是蟾酥中的活性成分. 田昕等［3］的研究表明, BL是一种有效的肿瘤细胞分化诱导剂，具有显著的抑制肿瘤生长的作用. 本研究通过实验观察Adi 对体外培养的人白血病K562细胞株增殖和凋亡的影响，为寻找到新的更有效的抗肿瘤药提供依据.

1材料和方法。

1.1材料。

Adi（生产批号：20060901，由第四军医大学药物研究所提供），实验前用生理盐水溶解，0.22 μm 滤膜过滤除菌后使其终浓度为1 mg/mL，4℃保存，测pH 值为7.2. 二甲基亚砜，四甲基偶氮唑盐(MTT)（美国Sigma 公司）；RPMI1640（GIBCO公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程公司）；K562细胞株（第四军医大学实验动物中心提供）.

1.2方法　　1.2.1细胞培养　　　将K562细胞悬浮培养在RPMI1640培养液中(含10 ml/L 加热灭活胎牛血清，1 mmol/L谷氨酰胺，1 mmol/L丙酮酸钠,青霉素、链霉素各10 ×105 U /L) ,培养条件为37℃，50 mL/L CO2饱和湿度，培养基为含10 ml/L小牛血清的RPMI1640，在37℃，50 mL/L CO2条件下培养，1～2 d传代1次，实验前24 h半量换液，用锥虫蓝拒染法鉴定细胞活性在0.98以上.

1.2.2MTT法检测。

K562细胞的活力采用文献［4］的方法检测细胞活力，实验时调整细胞数为1×105/ mL，在培养板上接种处于对数生长期的K562细胞，每孔加细胞悬液200 μL. Adi各处理组每孔加入Adi，终浓度分别为2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0和160.0 μg/mL；对照组每孔加入等体积生理盐水，每组均设3个复孔. 将培养板放至37℃，50 mL/L CO2温箱培养36 h，加入MTT 20 μL溶液，继续培养4 h后，离心，弃上清， 加入二甲基亚砜150 μL，微型混合器振荡，使结晶完全溶解，酶联检测仪在波长490 nm处测定每孔的吸光度(A)值. 实验重复3次.

1.2.3检测细胞凋亡率。

K562细胞经10.0，20.0 μg/mL Adi 处理并培养36 h，收集细胞(每组至少5×105个细胞)，参照文献［5］的方法采用Annexin VFITC及PI染色后上机操作，以未染色细胞将机器调零，以Annexin VFITC单染管和PI单染管作基准参照，选取散点图作直观显示.

1.2.4K562细胞的形态学观察。

5.0 μg/mL Adi 处理组和对照组K562细胞培养36 h后, 1000 r/min离心10 min，收集细胞. 用无血清培养液洗涤后再次1000 r/min离心10 min，沉淀用2.5 mL/L戊二醛固定2 h，1 mL/L锇酸固定1.5 h，乙醇梯度脱水，Epon812树脂包埋，超薄切片机切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，JEM2000EX透射电镜下观察.

统计学处理： 采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析，数据以x±s表示，统计学推断采用单因素方差分析，多重比较采用LSDt检验, P0.05为差异有统计学意义.