应用活性玻璃/rhBMP2构建生物活性材料支架的相容性研究
作者：丁金勇，靳安民，闵少雄，张梅霞，汤善华，王永峰。
【关键词】 成骨细胞。
观察BG／rhBMP2构建的三维立体材料支架的细胞相容性、组织相容性，为进一步改善材料性能提供依据。［方法］体外培养的兔成骨细胞分别与BG和BG／rhBMP2材料支架联合培养，倒置显微镜、扫描电镜观察细胞黏附情况，MTT法分析细胞增殖情况；将复合培养的两种支架材料植入兔肌袋中，同期观察复合材料及空白对照组，分别于术后2、4、8、12周来评价其组织相容性。［结果］MTT法结果显示：随着培养时间的延长，各组细胞数量都明显增加，各时间点复合材料支架组细胞数高于空白对照组，差异有显著性意义，复合材料支架BG／rhBMP2在细胞贴壁时间和细胞活性方面均较单纯支架优良；两种支架材料在体内均无明显炎症反应。［结论］BG／rhBMP2是一种具有良好生物相容性的支架材料，有望在骨组织工程中得到广泛应用。
关键词：细胞培养； 成骨细胞； 生物活性玻璃； 重组人骨形态发生蛋白2； 生物相容性。
Abstract：［Objective］To investigate the compatibility of tissue and cell in the threedimensional porous bioactive glass/recombine human Bone Morphogenetic Protein2 (BG /rhBMP2)materialscaffolds and provide a reference for improving the constitution of composite material.［Method］The material of BG and BG/rhBMP2 were cultured in vitro with rabbit osteoblasts respectively. The morphology and adhesion were examined by inverted microscope and scanning electron microscope, and the cell proliferation was detected by MTT assay. The composite materialscaffold were embeded in rabbit‘s muscle and incisions were observed. The specimens were harvested in 2, 4, 8 and 12 weeks respectively and examined by histology to evaluate the tissue response.［Result］The results showed the cells on BG and BG /rhBMP2 were good adhension and activity, the two materialscaffolds had no apparent inflammatory reaction in vivo. MTT assay showed the number of the cells in each group were significantly increased along with the culture time prolonged. The number of cells in the BG and rhBMP2 group was higher than that of the control group at different intervals, with a significant difference. The number of cells in the BG/rhBMP2 was not evidently higher than that of the BG with a significant difference.［Conclusion］The porous composite materialscaffold of BG/rhBMP2 has good biocompatibility with the hope to wide use in bone tissue engineering.
Key words: Cell culture; Osteoblasts; Bioactive glass; Recombine human Bone Morphogenetic Protein2; Biocompatibility。
具有三维空间结构的材料支架、种子细胞和生长因子并称为组织工程的三大核心问题［1］。生物活性支架材料的选择是其能否应用于临床的关键，生物活性玻璃是具有硅酸盐性质的异质移植材料。本文所用支架材料是将生物活性玻璃粉与无机造孔剂结合制成了生物活性玻璃多孔材料。本实验立足于探讨生物材料、生长因子复合体与成骨细胞及组织的生物相容性，判断其在骨组织工程研究中的应用前景。
1 料和方法。
11 材料的制作。
111 成骨细胞培养 10周龄新西兰大白兔(体重、雌雄不限)，(购自南方医科大学实验动物中心)，无菌条件下抽取双侧股骨髁部骨髓10 ml，按文献方法分离培养。成骨诱导剂与RPM1640组成完全培养基，将第2代细胞接种至培养板和培养瓶中，每孔加入完全培养基，48 h后全量换液，置于孵箱内培养。
112 生物活性玻璃(bioactive glass BG)支架材料制作 BG的分子质量10 g，为固体块状。选择粒径在150～200μm BG颗粒，应用溶胶—凝胶技术制得孔径约220 μm，孔隙率约75％的BG支架材料，切割成直径8 mm、厚约2 mm的薄片状，环氧乙烷熏蒸消毒备用。
113 复合载体的制备 已消毒的rhBMP溶解于RPM 1640液中，将切割BG浸入其中，置入700 MPa的真空仓中，使BG孔隙中空气被置换，取出后烤干。
12 成骨细胞鉴定。
121 细胞碱性磷酸酶(ALP)化学染色 将诱导分化的细胞培养10 d后采用偶氮偶联法染色，阳性细胞胞浆内有大紫黑色颗粒或弥漫深红色。
122 I型胶原抗体免疫组化染色 诱导分化的细胞培养8 d后固定、洗涤、过夜；用DAB显色试剂盒显色，复染、脱水、封固。
用RPM 1640培养基浸泡支架材料，将消化的成骨细胞制成的细胞悬液，将支架材料置于培养板中，设立空白对照，加入与支架相同大小的盖玻片1片，接种细胞悬液，孵箱培养，每2 d半量换液1次。
倒置显微镜、扫描电镜观察成骨细胞及其在材料上的生长、贴附情况；于接种后的2、4、6、8 d吸出培养基后每孔加入RPM1640培养基及四甲基偶氮唑盐(MTT)，在酶联免疫检测仪上测定A值；碱性磷酸酶活性测定按ALP试剂盒提供的方法进行。
15 动物实验。
30只12周龄新西兰大白兔(雌雄不限)，体重(1600±200)g，随机排列分为3组，每组10只。腹腔麻醉，背部做切口，钝性分离肌肉组织，将材料随机植入脊柱两侧肌肉组织，分别于术后2、4、6、8、12周后处死动物，切取植入区组织块，进行大体观察、光镜下观察。
16 统计学处理。
用SPSS100软件包多因素变化分析(ANOVA)分别比较各实验组与对照组指标的变化，LSD法行两两比较进行统计学分析。