病毒样颗粒疫苗的研究进展
【关键词】 VLPs; 疫苗; DCs。
病毒样颗粒（viruslike particles, VLPs）是不含病毒核酸的空壳结构, 许多病毒结构蛋白都具有自动组装成VLPs的能力, 在形态结构上与天然的病毒颗粒相似, 具有很强的免疫原性和生物学活性。由于VLPs不含有病毒遗传物质, 因此不具有感染性, 其中有些已经作为疫苗成功应用于临床。VLPs在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并将外源性抗原展示在其表面。此外, 多数病毒VLPs还具有包裹核酸或其他小分子的能力, 可作为基因或药物的运载工具。
多种病毒如人和动物的免疫缺陷病毒、 人乳头状瘤病毒、 麻疹病毒、 乙型肝炎病毒和汉坦病毒等的结构蛋白都能在各种不同的表达系统中自动组装成病毒样颗粒, 颗粒大小一般在20～150 nm之间。由于VLPs表面能够重复且高密度展示外源性表位从而引发强有力的免疫应答, 因此它对于多种疾病来说都是一种可开发理想的疫苗形式。最近, 倍受疫苗研究者关注的是, Merck公司研制的HPV6、 11、 16、 18四价VLP Gardasil疫苗已经在2006年6月获得美国FDA许可且已投放市场, 它被认为是上天对女性的恩赐［1］。由此, 人们对以VLPs为基础的疫苗研究更加热衷。现就基于VLP的疫苗研究情况进行综述。
1 VLPs的形成。
有些病毒样颗粒与天然形成的亚病毒颗粒（SVPs）相似。例如, 在酵母和哺乳动物细胞中表达的乙肝病毒小包膜蛋白形成22 nm大小的VLPs, 与在HBV感染患者血液中发现的天然产物SVPs相同。值得一提的是, 这些血浆来源的SVPs也就是之后的第1代HBV疫苗［2］。同样人乳头状瘤病毒的L1蛋白组装成的VLPs与病毒复制时形成的空病毒颗粒相似, 只是天然形成的空病毒颗粒还包含L2蛋白, 目前基于HPV L1蛋白的重组人乳头瘤病毒疫苗已取得执照并得到应用［1, 3］。另外, 有些嵌合型病毒样颗粒也可以提呈外源性表位和分子。这可以通过改变VLPs的基因序列来实现, 比如说通过从头合成的方式将VLP蛋白和外源性蛋白组合到一起。这方面最早的例子就是将一段肽序列连接到乙肝病毒核心抗原（HBcAg）上［4］。此外, 我们还可以通过化学结合的方式得到VLPs。通常情况下, 插入外源性基因序列或表位并不影响颗粒的形成和它的免疫原性。
但是, 一些病毒在形成VLPs的过程中也存在许多障碍。例如无包膜病毒（如HPV）, 有包膜病毒（如HBcAg）在自动组装过程中需要表达一个或多个壳蛋白, 这就需要它们的正确组装以形成颗粒结构［5］。如HBc分子核壳可分别由240、 180个相同的亚单位装配成为大小分别为34 nm、 30 nm的核心颗粒, 分别形成T=4、 T=3的正二十面体对称结构, 在其表面有刺突结构, 被称为MIR区, 是插入外源表位的最佳位置。这些壳蛋白可能是由一个前体蛋白加工而来, 也可能是一个细胞共表达多个壳蛋白［6］。有些病毒在细胞内自组装成VLPs后以出芽的形式释放出来, 它们包含有细胞的脂质, 从而形成了病毒的脂蛋白包膜。
多种表达系统都可产生VLPs, 包括哺乳动物细胞表达系统, 杆状病毒/昆虫细胞表达系统, 酵母表达系统及大肠杆菌等原核表达系统。酵母表达系统由于能够大量生产, 成本低, 表达容易使得它应用广泛, 但是蛋白的糖基化, 正确折叠, 及包装, 以及密码子的优化等都是选择表达系统时需要考虑的问题。大肠杆菌表达系统不允许蛋白糖基化, 酵母和杆状病毒表达系统对于甘露糖蛋白的修饰有限制作用。而通过杆状病毒表达系统包装的流感病毒VLPs由于与杆状病毒的颗粒大小相似, 都是80～120 nm从而很难分离。哺乳动物细胞表达系统对于蛋白表达后的加工修饰和正确折叠能起到作用, 但是它不易人为控制而且花费高, 所以应用受到了限制。
2 VLPs的免疫原性。
2.1 VLPs诱导体液免疫应答 VLPs在通常情况下比亚单位疫苗和重组的蛋白疫苗有更强的免疫原性, 能够刺激机体免疫系统产生很强的免疫应答。与天然病毒一样, VLPs的空间结构允许它展示抗原决定表位, 因此能够刺激机体产生中和抗体。机体对于VLPs呈现在其表面的抗原可以通过一种安全有效的方式诱导产生抗体, 在这方面可溶性抗原是望尘莫及的。一种新型戊型肝炎病毒VLPs免疫小鼠后能够有效的诱导小鼠产生特异性的HEV抗体, 并且随着免疫次数的增加抗体水平逐渐升高并至少可以持续3个月［7］。经乳头瘤病毒(PV)VLPs免疫的多种动物的血清中可检测到高滴度血清中和抗体, 后者能保护动物抵抗大剂量乳头瘤病毒的实验性攻击。另有试验证实用HPVVLPs经阴道免疫雌性小鼠后能检测到高滴度的阴道分泌性IgA 及血清IgG［8］。Gardasil和Cervarix疫苗Ⅲ期临床试验免疫后的女性体内产生高滴度的中和抗体, 对女性HPV感染及HPV相关性宫颈上皮非典型增生可起到有效的保护作用［1］。
2.2 VLPs诱导固有和适应性免疫应答 一般认为, VLPs在没有任何佐剂的情况下就可诱导较强的免疫应答, VLPs本身具有的佐剂效应是因为它们的大小适合被树突状细胞（DCs）摄取, 其高效摄取VLPs的可能机制包括: 吞噬、 渗透及TLR受体介导等。经过加工处理后的抗原可以被MHCⅡ类分子提呈, 促进DCs的成熟和迁移, 这个过程对激活固有免疫系统是十分重要的。外源的VLPs也能通过交叉提呈的方式, 通过MHCⅠ类途径进行提呈, 从而活化CD8+ T细胞, 实现CD8+细胞介导的保护性免疫反应, 这对于清除细胞内的病原体如病毒等至关重要。VLPs进入DCs细胞后能诱导其成熟, 使其细胞表面分子如CD40、 CD80、 CD86 及MHCⅠ和Ⅱ类分子表达水平明显上调, 同时促进DCs 分泌IL6、 IL10、 MIP1α及TNFα等细胞因子［9］。VLPs对于DCs的靶向特性对于VLP疫苗来说非常有利, 因为DCs被认为是连接固有免疫应答和适应性免疫应答的桥梁。一些VLPs与天然病毒相似, 仍然保留受体结合区, 从而可以通过受体进入细胞。研究表明, 副黏病毒受体介导的内吞是通过唾液酸与血凝素或神经氨酶相互作用［10］, HIV是由CD4分子与HIV1相互作用介导的, 而HCV与细胞的结合是包膜特异的, 但其中涉及的受体尚不清楚［11］。
3 VLPs与疫苗。
VLPs保留了天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位, 免疫性强, 不但能激发体液免疫, 而且可以激发细胞和粘膜免疫, 具有安全、 高效的特点, 是很有发展前景的候选疫苗或载体。VLPs作为疫苗可分为以下几类: VLPs疫苗、 嵌合VLPs疫苗、 VLPs耦联或交联疫苗以及VLPs冲击DCs后获得的DCs疫苗。
3.1 VLPs疫苗 多种病毒的壳蛋白或包膜成分都能形成VLPs, 这为我们研究病毒的包装和开发疫苗奠定了基础。HBV和HPV的VLPs已经被成功的制成疫苗并已投放市场, 但是有些病原体如HIV1和HCV等能够直接影响免疫细胞从而逃避机体免疫系统的监视, 因此这些对疫苗的研究将是个挑战。但是, 仍有许多研究者致力于这方面的工作, 因为以往的研究证实其他类型的疫苗对HIV感染者不能产生足够的保护。Hammonds等［12］的研究表明, HIV的VLPs能诱导体液和细胞免疫应答因而是一种很有潜力的疫苗, 他们改进了获得, 纯化等方法, 这对将来把HIV的VLPs用于临床前试验和应用于临床奠定了基础。研究证实, 许多个体多年面对病毒的慢性感染过程中没有产生足够的保护性免疫应答, 这暗示了尽管VLPs与天然病毒结构十分相似, 但是也许并不能够为机体提供有效的保护作用。因此在一些VLPs疫苗的设计上应该做一些适当的改变, 比如颗粒的大小, 包膜的结构等, 使其能够靶向DCs或是黏膜表面, 或是通过改变免疫途径使得疫苗产生最佳的免疫效果。
3.2 嵌合VLPs疫苗 嵌合型VLPs为异源性抗原与VLPs的结合提供了一条途径, 这其中包括一些不能自动包装成特定的形式的CTL表位和一些包膜蛋白的片段, 还包括那些没有良好免疫原性的病毒抗原如来自HIV和HCV的抗原。此外, 嵌合型VLPs也为发展同源VLPs提供了平台, 例如将E6/E7蛋白与HPV的L1蛋白融合［13］。相似的, 嵌合的VLPs也可以展示一些与其毫无关联的病毒或病原表位（例如将疟疾表位或是流感病毒的M2蛋白）连接到HBc上［14, 15］。对于这种嵌合型VLPs来说, 最大的局限性就是颗粒所能容纳的外源性表位较小, 不能够插入提呈一些大的抗原表位。Chen等［16］将在B、 T细胞水平具有免疫原性的HBV表面蛋白preS1的533个氨基酸连接到截短的HBc羧基末端形成嵌合蛋白HBVCS1。这种颗粒样蛋白在BALB/c小鼠体内能够诱导强烈抗HBc及中等强度的抗preS1的免疫应答和特异的T细胞应答。这种疫苗也能降低HBVTg小鼠血清中的HBsAg和HBV DNA的滴度。Nardin等［14］进行了一种候选疟疾疫苗的一期临床试验来检测疫苗的安全性和免疫原性, 这种疫苗就是带有表达疟原虫孢子表位的HBc核心颗粒, 临床前研究表明由大肠杆菌表达的这种病毒样颗粒在小鼠和猴体内具有很强的免疫原性。共有20名健康成人志愿者参与了一期临床试验, 接种剂量为50 μg的绝大多数志愿者体内都产生了针对疟疾抗原的抗体, 而且免疫1次之后就可检测到分泌IFNγ的抗原表位特异的T淋巴细胞。试验结果表明这是一种很有前途的疟疾候选疫苗并且证实HBc病毒样颗粒可以作为外源性抗原表位载体。
3.3 VLPs耦联或交联疫苗 将外源免疫原耦联到VLPs上同样可以使外源抗原以重复的方式最佳地展示在载体表面。VLPs耦联疫苗制备的方法是在VLPs免疫反应区中添加一个或多个赖氨酸, 在外源抗原上引入一个半胱氨酸, 这样可以通过一个双功能的交联剂将外源抗原共价地连接到VLPs载体上。
3.4 VLPs冲击的DCs疫苗 DCs是人体内功能最强的专职抗原提呈细胞, 也是惟一能够激活初始T淋巴细胞和静息T淋巴细胞的抗原提呈细胞, 从而激活抗原特异性的T细胞免疫反应。为了了解VLPs如何激活免疫系统, Lenz等［17］研究了乳头状瘤病毒样颗粒与人骨髓来源的抗原提呈细胞的相互作用。结果表明, VLPs能够黏附到单核细胞、 巨噬细胞和DCs的表面并诱导这些细胞成熟和分泌细胞因子。他们的实验也再次验证了VLPs能够靶向免疫系统的多种细胞, 解释了为何VLPs能够在没有佐剂的条件下诱导有效的体液和细胞免疫应答。
近年来DCs用于抗肿瘤免疫治疗日益受到重视, 现在通过在体外扩增DCs的同时采用肿瘤或病毒抗原冲击致敏DCs, 提高DCs的抗原提呈能力, 诱导抗原特异性免疫反应来清除肿瘤细胞。目前通过这种方法制成DCs疫苗的报道已经很多, 也取得了一定的成功。但也存在一些缺憾, 例如在诱导长效抗原特异性免疫应答方面还不尽人意。其最主要的问题可能是, 抗原负载方式存在缺陷, 而导致DC细胞的抗原递呈效率较差, 或使DCs的寿命缩短, 进而使诱导长效的T细胞应答受到限制。最近本实验室［18］用HBcVLPs负载的DCs疫苗免疫小鼠, 有效地激发小鼠的抗原特异性免疫应答, 而且明显抑制肿瘤在小鼠体内生长, 说明用VLPs冲击也不失为一种有效的DCs疫苗的制备方式。另外一个问题在设计疫苗时需要考虑的是, 如果是治疗性疫苗, 则要求包含特异性的T细胞表位来达到特异性的杀伤目的。这种治疗性VLPs疫苗若包裹了CpG作为佐剂可以提高疗效, 因为CpG可以通过Toll9受体来激活DCs。一种插入了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎的CTL表位的HBcVLPs疫苗如果包裹了CpG之后会诱导产生更多的肽特异的CD8+T细胞［19］。本室Song等［18］结果也证实HBcVLPs包裹CpG后获得长效的抗原特异性免疫应答和抗肿瘤作用。用HBcVLPs负载的DCs免疫小鼠, 可诱导其产生抗原特异性T细胞应答; 包裹CpG的HBcVLPs负载DCs后免疫小鼠, 分泌IFNγ的CD8+T细胞数增多和CTL活性增强, 从而明显增强了疫苗的免疫效果和抗肿瘤作用。