磷酸肌酸对大鼠缺血再灌注损伤心肌线粒体MDA、SOD和Ca2+表达的影
作者：孟祥雁 包晓群 罗媛媛 高长斌。
【摘要】 目的 探讨磷酸肌酸(PCr)对缺血再灌注(I/R)损伤心肌线粒体的影响。方法 采用大鼠左冠状动脉前降支结扎法建立大鼠I/R模型。60只雄性大鼠随机分为缺血再灌注(I／R)损伤组、假手术组、PCr组，假手术组只剖胸不结扎冠状动脉，余两组制作I／R模型，PCr组结扎前45 min经股静脉注射PCr 4 mg／kg，假手术组和I/R组分别静脉注射相应体积的生理盐水，在缺血45 min及2 h时测定I／R区心肌丙二醛(MDA)、超氧化物歧化物(SOD)及总Ca2+浓度。结果 与假手术组比较I/R损伤组MDA、总钙显著增高(P＜0.05)，SOD显著降低(P＜0.01)；与I/R损伤组比较，PCr组MDA含量及总钙水平显著降低(P0.05)，SOD显著增高（P＜0.01）。结论 PCr对心肌I/R损伤有保护作用。
心肌缺血时磷酸肌酸(PCr)是一种最主要最直接的功能物质，而内源性PCr极其有限的，所以提供外源性PCr参与细胞能量的供应可解决心肌保护的根本问题——能源。国外学者对于外源性PCr能否补充恢复耗尽的能量储备，作了大量研究，并证明PCr是一种极易被心肌细胞使用的能量形式〔1〕。通过PCr的标记实验发现心肌中有放射性分布，证明外源性PCr可以增加细胞内PCr的总体水平，而且当心肌缺血时，这种穿透力增强。本实验观察了PCr对体外大鼠心肌线粒体中丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活力和Ca2+浓度的影响，并探讨其作用机制。
1 材料与方法。
1.1 材料。
成年雄性Wistar鼠60只，体重300～400 g，由吉林大学医学实验室提供，合格证号：吉动质20051024。MDA、SOD、ATP酶检测试剂盒均为南京建成生物工程研究所提供。台式高速离心机MC沪0000193（上海手术器械厂），LMZ－Z二道描记式记录仪（成都仪器厂），微型动物呼吸机（吉林大学第二医院中心实验室提供）。PCr由海口奇力制药有限公司提供，批号20050503。
1.2 模型制作及分组。
60只大鼠随机分为假手术组(Sham)，缺血再灌注(I/R)损伤组，PCr组，每组20只。Wistar大鼠称重后术前禁食12 h，2.5%戊巴比妥钠溶液（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉后固定于手术台上，手术部位备皮、消毒，并连接心电图肢体导联。于3、4气管软骨环间行气管切开插管，接动物呼吸机（潮气量约20 ml/kg，呼吸频率60次/min）。沿左侧胸骨旁斜切口，依次切开皮肤、浅筋膜及深筋膜，钝性分离胸大肌和前锯肌，直至暴露出肋骨及肋间肌，于左胸3、4肋间开胸（钝性分离肋间肌），用开胸器撑开肋间，暴露心脏，剪开心包，挤出心脏。以无损伤缝合线（70）在左心耳根部和肺动脉圆锥左缘交界处下方1 mm处穿过左冠状动脉前降支，而后迅速将心脏放回胸腔，并将缝线扎紧。此时观察心电图变化，若肉眼观察结扎区变为紫色，同时QRS波增高、增宽及不同肢体导联出现ST段弓背上抬0.2 mV以上，持续30 min则为结扎成功。结扎45 min后松解结扎线使之再灌4 h，即为心肌I/R模型。假手术组只在左冠状动脉前降支下穿线，不结扎，余步骤同上〔2〕。建立大鼠I/R模型后，PCr组在结扎前45 min经股静脉注射PCr 4 mg/kg，假手术组和I/R组则静脉注射相应体积生理盐水。
摘取大鼠左心室结扎线以下游离的心室壁心肌0.2 g，用冰生理盐水洗净，倒入玻璃匀浆管中，加入9倍于心脏重量的冰冷匀浆介质，将玻璃匀浆管插入盛有冰水混合物的容器中匀浆，将制备好的匀浆移入2 ml离心管，用低温低速离心机以2 000 r/min离心10 min，4℃离心15 min，弃上清沉淀物即为线粒体，将分离的线粒体用20倍的冰冷匀浆介质制备成混悬液，0℃～4℃储存待测。
取各组线粒体混悬液，采用硫代巴比妥酸法〔3〕，按照MDA测定试剂盒说明书的步骤进行，SOD检测采用黄嘌呤氧化酶法。
1.5 大鼠心肌细胞线粒体Na+K+ATP、Ca2+Mg2+ATP酶活性测定。
取各自线粒体混悬液，按文献方法〔4〕配制反应介质，总ATP酶反应介质（mmol/L）：咪唑100，CaCl2 2.5，KCl 0.1，MgCl2 0.1，ATP 2，Na 4，线粒体膜蛋白60 μg，Mg2+ATP酶反应介质为上述介质， CaCl2 2加4 mmol/L ED7A，总反应体积0.4 ml，37℃反应10 min，用冷10％三氯醋酸终止反应，离心后吸取上清液测定无机磷含量、Ca2+Mg2+ATP酶活性含量，具体测定按照ATP测定试剂盒说明书步骤进行。
1.6 统计学处理。
所有数据用x±s表示，采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析检验。
2 结果。
2.1 PCr对心肌I/R损伤大鼠线粒体MDA、SOD、 Ca2+的影响。
与假手术组比较，I/R损伤组大鼠血清MDA、Ca2+含量明显增加（P＜0.05），SOD活性明显降低（P＜0.01）。与I/R损伤组比较PCr组能明显降低大鼠血清MDA含量、Ca2+含量（P＜0.05），SOD活性明显提高，见表1。表1 各组大鼠心肌线粒体中MDA、SOD、Ca2+的变化(略)。