乙醇对慢性丙型肝炎患者HCV基因型分布及肝损害的影响

作者：孙慧慧　王敏　张孝国　陈建　刘靓文　智绪亭。

【摘要】 目的：对比嗜酒与非嗜酒的慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)患者HCV RNA基因型及分布，以明确嗜酒的CHC患者病情发展是否与某种特定基因型有关。检测CHC患者IFN—γ 及TNF—α水平，了解嗜酒的HCV感染者肝损害的机制。方法：收集CHC患者114名，分为嗜酒组和非嗜酒组，以基因芯片技术对2组患者进行HCV RNA基因分型。采用Ficoll梯度离心法提取所有患者外周血单个核细胞(PBMC)并培养，ELISA法检测IFN—γ及TNF—α的水平。结果：嗜酒组和非嗜酒组HCV RNA的基因型均以1b型为主(嗜酒组的比例为60%，非嗜酒组为43.75%)，二者之间无统计学意义(P=0.22)。嗜酒组和非嗜酒组的HCV RNA定量测定分别为(11 100±14 174.3)×103 mL—1和(3 927.8±4 549.6)×103 mL—1，二者比较差异有统计学意义(P=0.025)。嗜酒组和非嗜酒组TNF—α水平分别为(4 528±3 587) ng/L和( 3262±3 131) ng/L，二者相比差异有统计学意义(P=0.048)，但2组IFN—γ水平差异无统计学意义(P0.05)。结论：乙醇促CHC肝患者HCV RNA复制，导致肝损伤加重，但并不能增加慢性HCV感染者对某种HCV RNA基因型的易感性。TNF—α在嗜酒的CHC患者中起重要作用，是导致肝损害的重要细胞因子之一。

【关键词】 肝炎病毒，丙型·乙醇·基因型·IFN—γ·TNF—α。

【ABSTRACT】 Objective：To analyze the genotypes of HCV RNA in alcoholic and nonalcoholic HCV patients and contrast the distribution of the genotypes between those, identifying whether alcoholic patients have a higher susceptibility to certain genotype than nonalcoholic patients. Meanwhile ,to detect the level of IFN—γand TNF—αfor gaining the mechanism of hepatic lesion in alcoholic HCV patients. Method： 114 HCV patients, according to the history of alcohol abuse, were divided into the alcohol group and nonalcohol group. The genotypes of HCV RNA in the two groups were performed by gene chip technique. Liver biopsy was practiced in 30 patients to diagnose. Ficoll gradient centrifugation and ELISA were used for extraction of PBMC and detection of IFN—γand TNF—α,respectively. Result：The genotype 1b was greater than other genotypes in the two groups, and there was no statistical significance (Alcohol group was 60% and nonalcohol group was 43.75%, P=0.22). The serum titers of HCV RNA of alcohol group were(1 1100±14 174.3)×103copies/ml and the nonalcohol group were(3 927.8±4 549.6)×103copies/ml,and there was statistical significance between the two groups (P=0.025). Among 18 alcoholic patients of 30 patients practiced liver biopsy, their liver inflammation was higher than nonalcoholic patients. The level of TNF—αof the alcohol was higher than that of nonalcohol, there was statistical significance between the two groups(P=0.048) and no statistical significance between those of IFN—γ.Conclusion：Alcohol can promote the copies of HCV RNA in HCV patients and aggravate liver injury, but can‘t add susceptibility to certain genotypes of HCV RNA. The liver inflammation of alcoholic patients is higher than that of nonalcoholic patients. TNF—α,which builds an important effect in alcoholic HCV patients , is one of the important mechanisms in the liver injury .

【KEY WORDS】 Hepatitis, C virus·Alcohol·Genotype·IFN—γ·TNF—α。

嗜肝病毒和乙醇是肝病的主要病因。在HBV和HCV感染的基础上饮酒，或者在乙醇性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的基础上并发HBV和HCV感染，都可加速肝脏疾病的发生和发展，患者将更易发展为慢性肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌[1]。目前研究认为HCV和HBV感染，可与乙醇的肝毒性作用呈协同效应，而HCV感染可能更加突出[2]。越来越多的证据表明酗酒是HCV相关性肝脏疾病进展的重要辅助因子，宿主与病毒之间的相互关系还不清楚，影响疾病发展的病毒因素包括病毒的基因型、不均一性和病毒的血清载量[3]。国内的研究主要是HCV RNA基因型在人群中的分布，对其在嗜酒者与非嗜酒者中分型的研究甚少。本研究采用基因芯片技术进行HCV RNA基因分型，比较其在嗜酒者与非嗜酒者中的分布，判断嗜酒的慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)患者病情发展与特定基因型的关系。同时检测患者IFN—γ 及TNF—α的水平，初步研究嗜酒的HCV感染者肝损害的机制。

1　资料与方法。

1.1　一般资料　收集CHC患者114例，山东大学齐鲁医院10例，济南市传染病医院104例，所有患者HBsAg均为阴性;抗—HCV 均为阳性，诊断均符合2000年全国第五次传染病寄生虫病会议修订的《病毒性肝炎防治方案》[4]。所有患者均通过CAGE问卷调查[5]，对提示有饮酒相关疾病的患者详细询问饮酒种类、日饮酒量、饮酒年限，进行酒精量换算，计算其累计乙醇摄入量。乙醇(g)=含乙醇饮料(mL)×乙醇含量(﹪)×0.8(乙醇比重);累计乙醇摄入量=日平均乙醇摄入量(g)×365×饮酒时间(年)。累计乙醇摄入量超过100 kg或每日乙醇摄入量超过60g、持续5年以上者作为嗜酒组，余为非嗜酒组。本研究嗜酒组50例，均为男性，平均年龄(48.7±8.7)岁，非嗜酒组64例，其中男40例，女24例，平均年龄(51.9±9.6)岁。2组肝功能比较差异无统计学意义(P0.05)，但在性别上存在较大差异，主要是嗜酒组的病例来源均为男性。

1.2　主要试剂　HCV病毒基因分型检测芯片、试剂盒及HCV基因分析软件购自宁波瑞芯科技有限公司;淋巴细胞提取液购自晶美公司。RPMI1 640培养液购自Gibico公司;细胞因子ELISA检测试剂盒购自晶美公司。

1.3　检测指标和方法。

1.3.1　血清HCV RNA基因分型　用逆转录聚合酶链反应法(RT—PCR)检测所有患者的HCV RNA，记录HCV RNA的拷贝数。对HCV RNA阳性患者采用基因芯片技术进行基因分型。

1.3.2　PBMC的提取和细胞因子的检测　采用Ficoll梯度离心法提取所有患者外周血PBMC。将分离的PBMC用含有100 mL/L混合人血清的完全RPMI 1640培养液稀释细胞密度为5×109 L—1。以100 μL/孔加于96孔板，37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中培养，72 h后收集培养上清，—20 ℃冻存。同时设不加细胞的阴性对照和加入ConA(刀豆蛋白，2 mg/L)刺激的阳性对照。用ELISA法检测上清中IFN—γ及TNF—α的水平。

1.4　统计学处理　应用SPSS 13.0统计软件包进行分析，数值型变量以x±s表示，样本均数的比较采用t检验，计数资料间比较采用χ2检验(或四格表精确概率法)。P≤0.05为差异有统计意义。

2　结果。

2.1　嗜酒组与非嗜酒组肝功能情况　嗜酒组与非嗜酒组ALT、AST。r—GGT比较差异均无统计学意义(P0.05，表1)。嗜酒组与非嗜酒组的肝功能比较见表1。

2.2　嗜酒组与非嗜酒组基因分型　114例CHC患者中，HCV RNA(—)6例，其中嗜酒组2例，非嗜酒组4例，2组之间差异无统计学意义(P=0.71)。按照HCV基因分型检测芯片说明书对基因分型结果进行判读。嗜酒组和非嗜酒组的基因型均以1b型为主，分别为60.00%(30/50)和43.75%(28/64)，二者之间差异无统计学意义(P=0.22);2组患者在基因型2a、混合型及未分型上比较差异也均无统计学意义(P0.05，见表2、图1)，2组基因分型比较结果及基因分型图分别见表2和图1。

嗜酒组血清HCV RNA高于非嗜酒组，2组分别为(11 100±14 174.3)×103 mL—1和(3 927.8±4 549.7)103 mL—1(P=0.025)。

2.3　PBMC体外培养及IFN—γ和TNF—α的水平测定　所有CHC患者PBMC培养上清中均检测到IFN—γ及TNF—α。嗜酒组TNF—α为(4 528±3 587)ng/L，非嗜酒组TNF—α为(3 262±3 131)ng/L，2组比较差异有统计学意义(P=0.048);嗜酒组与非嗜酒组IFN—γ水平分别为(31.0±27.07) ng/L和(34.0±22.0) ng/L，2组比较差异无统计学意义(P=0.51)。