诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、 鉴定和初步应用

【摘要】 目的: 建立能稳定分泌抗诺如病毒（Norovirus）N蛋白的单克隆抗体（mAb）细胞株, 制备抗诺如病毒核衣壳蛋白的mAb, 为诺如病毒的早期快速检测及致病机制的研究提供实验材料。方法: 用E.coli表达的GⅡ组广州株NVgz01（DQ369797）NorovirusN蛋白免疫BALB/c小鼠, 通过PEG使小鼠脾细胞和Sp2/0细胞融合, 使用HAT选择性培养基培养融合细胞, 用间接ELISA和Western blot测定mAb的效价、 免疫球蛋白亚型和mAb的特异性, 并将各mAb之间进行配对。结果: 通过细胞融合和克隆化, 共筛选出4株分泌抗NorovirusN蛋白抗体的杂交瘤细胞株N2C3、 N7C2、 N4B1、 N8A9。间接ELISA和Western blot检测结果表明, 这4株mAb都可以与E.coli表达的GⅡ组广州株NorovirusN蛋白产生特异性反应, 并且能与天然粪便标本中的GⅡ组Norovirus产生特异性反应。配对结果显示N2C3和N7C2之间配对, 对表达蛋白和天然病毒都具有较强的检测灵敏度。结论: 获得了诺如病毒GⅡ组特异性mAb, 为制备免疫诊断试剂盒及致病机制的研究奠定了基础。

【关键词】 Norovirus NVgz01 核衣壳蛋白 单克隆抗体。

诺如病毒作为流行性肠胃炎的主要病因之一, 无论在发展中国家还是发达国家, 从儿童到成年人都可以受到诺如病毒感染, 并可造成爆发流行, 成为影响人类健康的不可忽视的问题, 近年来逐渐引起了研究者的重视。美国CDC经过评估认为, 每年在美国发生的食源性疾病有2 300万宗是由诺瓦克及诺瓦克样病毒引起的［1］; 在欧洲, 数据显示1995～2000年间, 有超过85％的食源性病毒肠胃炎爆发案例由诺瓦克及诺瓦克样病毒引起［2］。由于人类诺如病毒分为GⅠ和GⅡ两组［3, 4］, 根据北京［5］、 太原［6］和武汉［7］三地的血清学调查结果, 初步认为GⅡ组病毒为我国主要流行组。由于诺如病毒无法在体外感染细胞及动物模型来进行培养分离鉴定, 目前对诺如病毒的诊断方法主要是免疫电镜法（IEM）、 放射免疫法（RIA）、 ELISA法、 RealTimePCR法等［8］, 其中, 夹心ELISA方法, 即使用单克隆抗体(mAb)捕获患者粪便标本中的病毒抗原来进行检测的方法, 由于交叉反应性小, 特异性较强且敏感度较高, 成为目前研制诺如病毒检测试剂所主要采用的方法。本研究中我们以E.coli表达的GⅡ组广州株NorovirusN蛋白作为免疫原, 免疫BALB/c小鼠并制备mAb, 为研制诺如病毒检测试剂盒奠定基础。

1 材料和方法。

1.1 材料 诺如病毒粪便标本为使用DakoCytomation公司的IDEIA Norovirus 抗原检测试剂盒检测为阳性的标本。6周龄的雌性BALB/c小鼠, 购自中山大学实验动物中心。Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系为本实验室保存。诺如病毒核衣壳蛋白表达重组质粒 pET28a（＋）NoroNP由本实验室制备及保存, 诺如病毒N蛋白基因的克隆、 表达和鉴定方法见文献报道［9］。PEGMW3350购自Sigma公司, HAT、 HT 和RPMI1640购自Gibco公司, 新生牛血清购自杭州四季青公司, 羊抗鼠IgG购自BOSTER公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法。

1.2.1 免疫小鼠 用pET28a（＋）NoroNP重组表达载体表达诺如病毒GⅡ组广州株的全长衣壳蛋白, 收集产物经Ni2＋亲和层析柱纯化, 以此纯化后蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠, 每次免疫剂量为70 μg/只, 免疫途径为腹腔免疫, 每间隔2周免疫1次, 累计免疫3次, 初次免疫使用弗氏完全佐剂, 后两次免疫使用弗氏不完全佐剂; 第3次免疫完成10 d后小鼠尾部取血检测免疫效果, 血清效价达到104后可脾内注射进行加强免疫, 3 d后取脾融合。

1.2.2 细胞融合 取免疫后小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按常规融合方法融合。

1.2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化 融合后细胞用含HAT的RPMI1640培养液进行筛选, 10 d后待杂交瘤细胞生长至视野的1/3大小时, 取100 μL细胞上清用ELISA方法对抗体进行检测。采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行多次克隆化, 待所有单克隆细胞培养液中抗体阳性率为100%时, 将生长状态良好并抗体ELISA值高的单克隆细胞扩大培养。

1.2.4 腹水的制备及效价测定 将6周龄以上的BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL/只弗氏不完全佐剂, 诱导1周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞, 7～10 d后可产生腹水。收集腹水离心除去细胞碎片。用重组蛋白(5 mg/L)作为抗原包板, 腹水从10—2起10倍稀释至10—7作为一抗（连续梯度稀释）, 羊抗鼠IgG作为二抗, 用间接ELISA方法对腹水效价进行测定。

1.2.5 mAb免疫球蛋白亚类鉴定 采用PIERCE公司的Monoclonal Antibody Isotyping Kit(HRP/ABTS)对mAb的亚类进行鉴定, 按试剂盒说明书进行。

1.2.6 mAb特异性检测 用Western blot方法测定mAb对GⅡ组广州株诺如病毒衣壳蛋白, 及对天然GⅡ组诺如病毒粪便标本的特异性反应情况。

1.2.7 mAb配对试验和初步应用 将效价较强的N2C3、 N7C2、 N4B1 3株mAb用硫酸铵辛酸法纯化［10］, 并分别将这3株抗体用辣根过氧化物酶（HRP）标记。将纯化过的抗体分别用5 mg/L浓度包被酶标板作为一抗, 诺如病毒衣壳蛋白作为抗原, 标上HRP酶的3株抗体分别作为二抗, 使用ELISA夹心法对mAb进行配对试验。配对完成后挑选灵敏度相对较高而本底相对较低的配对方式, 与PCR方法（本实验室建立）检验为诺如病毒GⅡ组阳性的水样腹泻患者粪便标本进行反应。

2 结果。

2.1 分泌抗诺如病毒衣壳蛋白mAb的杂交瘤细胞株的建立 用pET28a（＋）NoroNP重组表达载体表达诺如病毒GⅡ组广州株的全长衣壳蛋白免疫小鼠, 取小鼠血清测效价, 在满意滴度下将小鼠进行脾内加强免疫, 3 d后取脾细胞与Sp2/0细胞进行融合。10 d后用纯化的NVNP 5 mg/L包被酶标板, 杂交瘤细胞上清作为一抗, 羊抗鼠IgG作为二抗检测抗体, 并同时用pET28a（＋）载体表达的轮状病毒蛋白作为阴性对照, 以排除与大肠杆菌BL21细胞成分和pET28a（＋）载体成份反应的假阳性抗体。对抗体分泌能力强的培养孔用有限稀释法进行2次克隆化, 共筛选出4株能稳定分泌抗诺如病毒核衣壳蛋白抗体的细胞株, 分别为N2C3、 N7C2、 N4B1、 N8A9。

2.2 腹水效价的测定 收集腹水, 用间接ELISA方法测定, 结果N2C3和N7C2 2株抗体最强, 腹水稀释至10—6P/N值为0.4; N4B1株抗体较弱, 腹水稀释至10—4P/N值为0.5; N8A9株抗体最弱, 腹水稀释至10—3P/N值为0.3（阴性对照P/N值为0.08）。

2.3 mAb免疫球蛋白亚类鉴定 用PIERCE公司试剂盒对mAbIg的类型和亚类进行特异性鉴定, 结果2株mAb鉴定为IgG2a（N2C3和 N4B1）, 2株mAb鉴定为IgM（N7C2和 N8A9）, 4株mAb轻链均为к链。

2.4 mAb特异性检测 4株mAb分别与表达重组蛋白和诺如粪便标本进行Western blot检测, 表达重组蛋白上由于带有表达载体上的T7和（His6）标签, 因而Mr比天然诺如病毒核衣壳蛋白（Mr为56×103～58×103）多了3×103左右。Western blot结果见图1, mAb不仅可以同表达重组蛋白进行特异性反应, 并且可以同天然诺如病毒核衣壳蛋白进行特异性反应。其中N2C3和N7C2的反应性较强, N8A9和N4BI对粪便标本的反应性较弱。

图1 mAb的Western blot分析（略）。

Fig 1 Western blot analysis of expression products in E.coli and native NV stool sample with four mAbs。

A: N2C3; B: N8A9; C: N7C2; D: N4B1. 1: Native norovirus stool sample; 2: Expressed recombinant protein of Norovirus NVgz01.