两步串联层析法纯化鼠抗人CD28单克隆抗体2F5
作者：马泓冰, 孙中文, 徐颖, 李文香, 陶然, 陈洁, 张学光 毕业论文。
【关键词】; 固相化金属螯合层析法;,凝胶过滤层析法;,纯化;,单克隆抗体 毕业论文。
[摘 要]; 目的: 建立从小鼠腹水中纯化鼠抗人CD28单克隆抗体(mAb)2F5的两步串联层析法。方法: 将含mAb 2F5的腹水经离心、 过滤及缓冲溶液变换预处理后, 先经固相化金属螯合亲和层析法(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)纯化, 去除大部分杂蛋白, 再经凝胶过滤层析法(gel filtration, GF)精细纯化, 并探讨了上样的流速和洗脱液的种类对mAb 2F5纯度的影响。纯化的mAb 2F5的生物学活性用3HTdR掺入法进行分析。结果: 以两步串联层析法纯化的鼠抗人CD28 mAb 2F5的纯度大于90%, 总回收率达70%。纯化的mAb 2F5在体外对PBTC具有明显的促增殖作用; 而且其促增殖作用的活性优于Protein G亲和层析法（affinity chromatography, AC）纯化所获得mAb。结论: 建立的两步串联层析纯化方法操作简便, 所得mAb的纯度高、 生物学活性好。 毕业论文。
[关键词]固相化金属螯合层析法; 凝胶过滤层析法; 纯化; 单克隆抗体 毕业论文。
CD28分子在信号转导及自身免疫性疾病等中的作用已成为目前研究的热点[1, 2]。为了深入研究其功能, 本研究小组制备了鼠抗人CD28 单克隆抗体（mAb）2F5, 并研究了其纯化方法。目前纯化mAb的方法很多, 如离子交换[3]、 疏水层析[4]及亲和层析[5]等, 这些方法各有其优缺点, 固相化金属螯合亲和层析法（IMAC）是近年来发展起来的一项新型分离技术, 具有配基简单、 不易泄漏、 吸附量大、 分离条件温和及通用性强等优点, 已成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一[6], 但尚未见用于纯化小鼠腹水中mAb的报道。由于小鼠腹水中含有某些杂蛋白成分, 单独使用IMAC法时, 往往达不到较好的纯化效果, 通常需要串联其他层析法进行纯化才能获得高纯度的活性抗体[7]。我们采用IMAC与凝胶过滤（GF）两步串联的层析法, 对小鼠腹水中鼠抗人CD28 mAb 2F5进行了纯化。建立的方法具有操作简单、 mAb纯度高及生物学活性好等特点。 毕业论文。
1; 材料和方法。
毕业论文。
1.1; 材料; 含mAb 2F5的小鼠腹水由本室制备。外周血T细胞（PBTC）由通过Ficoll密度梯度法和磁珠阴性选择去除CD19、 CD56阳性细胞后获得。BioLogic DuoFlow中高压层析仪（检测波长为280 nm）、 IMAC层析柱（1.0 cm×3.2 cm, 内填装有末螯合Ni2+的填料）、 GF层析柱（1.0 cm×64 cm, P100填料, 分离范围5000～100100 Daltons）、 脱盐层析柱（2.5 cm×10 cm, P6填料, 分离范围1000～6000 Daltons）、 MiniProtean 3电泳仪、 SmartSpec3000紫外可见分光光度计、 Gel Doc1000凝胶成像系统及蛋白质Lowry法定量试剂盒, 均为BioRad公司产品。其他试剂均为分析纯试剂。 毕业论文。
1.2; 方法 毕业论文。
1.2.1; IMAC层析柱纯化; 将装填好的IMAC层析柱连接到层析仪上, 对IMAC填料进行Ni2+螯合(参见填料说明书)后, 用5倍柱体积（CV）的上样缓冲液A（以咪唑浓度梯度洗脱时, 上样条件为pH8.0的50 mmol/L PB+5 mmol/L咪唑; 其他洗脱条件时, 为pH8.0的50 mmol/L PB+0.5 mol/L NaCl）充分平衡层析柱。取含有mAb 2F5的小鼠腹水5 mL, 加入适量的SiO2粉末, 振荡30 min, 以9000 r/min离心20 min。取上清, 过0.22 μm滤膜, 加入到经缓冲液A平衡的脱盐柱并以缓冲液A做为流动相进行洗脱, 接收洗脱流份, 置4℃待用。取500 μL经上述预处理后的样品上样（流速依据实验条件的不同分别调整为0.1、 0.3、 0.6、 1.0 mL/min）, 用洗脱缓冲液B（洗脱条件依据实验条件的不同, 分别采用pH8.0～4.0的梯度、0～1.0mol/L NH4Cl的浓度梯度和10～300mmol/L咪唑的浓度梯度）进行洗脱。洗脱步骤为: 100%A液洗脱10CV, 用0%～100%B液洗脱10CV, 再用100%B液洗脱4CV, 洗脱流速为1.0 mL/min, 收集蛋白峰。 毕业论文。
1.2.2; GF层析柱纯化; 将装填好的GF层析柱连接到BioLogic DuoFlow中高压层析仪上, 用缓冲液（pH72的20 mmol/L PBS）充分平衡层析柱后, 以IMAC层析柱的洗脱馏份为样品上样, 上样及洗脱的流速均为0.2 mL/min, 收集蛋白峰。 毕业论文。
1.2.3; 纯化的mAb 2F5的SDSPAGE鉴定; 取纯化的mAb 2F5样品在还原条件下进行SDSPAGE（分离胶浓度为100 g/L, 浓缩胶浓度为50 g/L）。电泳后, 以考马斯亮蓝R250染色, 再经凝胶成像仪扫描鉴定mAb 2F5的纯度。纯化的mAb 2F5的浓度采用Lowry法试剂盒进行定量。 毕业论文。
1.2.4; mAb 2F5促进PBTC增殖的作用; 采用3HTdR法。以激发型鼠抗人CD3 mAb（0.25 mg/L）包被96孔板（100 mL/孔）, 加入一定密度(5×106/mL)的细胞悬液（100 mL/孔）, 然后分别加入经IMAC+GF两步串联层析法及常规Protein G亲和层析法[9]纯化的不同浓度（0.1、 0.25、 0.5、 1.0、 2.5 mg/L）的mAb 2F5, 同时设小鼠IgG1同型及只加激发型抗CD3 mAb的对照组。培养56 h后, 加入3HTdR(3.7×104 Bq/孔), 继续培养至72 h, 采用液闪仪测定各孔的cpm值。 毕业论文。