川芎嗪抑制大鼠局灶性脑缺血损伤神经元凋亡的作用

作者：柳朝阳 孙鹏 苗志 张涛 王建杰。

【摘要】 　　目的 研究川芎嗪抑制大鼠局灶性脑缺血损伤神经凋亡作用的机制。方法 采用线栓法制作大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型，通过TUNEL染色及免疫组化染色动态观察川芎嗪对脑缺血再灌注大鼠神经元凋亡及bcl2、p53蛋白表达的影响。结果 再灌注各时间点，与缺血再灌注组相比，川芎嗪治疗组凋亡细胞数明显减少(P0.01)，而 bcl2 蛋白阳性细胞数明显增多(P0.05)。结论 川芎嗪能抑制脑缺血再灌注损伤神经元凋亡，其机制可能与上调bcl2蛋白表达有关。

【关键词】 川芎嗪；局灶性脑缺血；凋亡；bcl2。

川芎嗪为中药川芎的有效成分，化学结构为四甲基吡嗪( tetramethylpyrazine， TMP)，在体内吸收后，能有效透过血脑屏障，并广泛分布大脑皮层、脑干、纹状体、海马、小脑和中脑等部位。近十几年来，TMP扩张血管的机制已有许多研究〔1〕。本研究采用川芎嗪干预大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血（MCAO）模型，动态观察神经细胞的形态改变以及bcl2蛋白表达情况，探讨川芎嗪对局灶性脑缺血损伤神经保护的机制。

1 材料与方法。

1.1 药品及试剂。

川芎嗪注射液40 mg/2 ml(北京第四制药有限公司生产，批号20060701)，TUNEL染色试剂盒及bcl2蛋白免疫组化染色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 动物分组及模型制备。

成年健康雄性Wistar大鼠36只，参照Longa等〔2〕的大脑中动脉线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞模型。缺血2 h后，将栓线向外轻轻拉出，恢复供血，形成再灌注。手术动物清醒后，出现左侧Horner征、右侧前肢肢体无力、肌张力降低则提示MCAO模型制作成功。模型制作成功后，按照随机原则， 首先分为缺血再灌注组（18只）和川芎嗪治疗组（18只），两组在脑缺血2 h后再灌注6、12、24 h共3个时间点各分为3个亚组，每组6只大鼠。治疗组大鼠在MCAO模型制备成功后分别腹腔注射川芎嗪40 mg/ kg；缺血组在相同时间点均腹腔注射等量生理盐水。

1.3 标本制备。

再灌注后相应时间点对各组模型动物以2 ml 10%水合氯醛腹腔注射麻醉至深度昏迷，迅速开胸暴露心脏，以100 ml肝素生理盐水经主动脉弓快速灌注冲洗，随后以4%多聚甲醛PBS缓冲液(4℃，pH7.4)经主动脉弓灌注30 min。迅速取脑，冠状切开脑组织，取视交叉前后约0.5 mm处的组织，置于上述固定液中24 h。常规石蜡包埋，于视交叉处连续冠状切片，片厚5 μm，切片置于4℃保存备用。

1.4 TUNEL染色检测原位细胞凋亡 　　取已制备好的石蜡切片常规脱蜡、脱水、双氧水处理、蒸馏水洗涤后严格按照说明书逐步进行，使用DAB显色试剂盒，着棕黄色为阳性细胞。

1.5 免疫组化染色检测bcl2蛋白表达。

严格按照试剂盒说明书逐步进行操作，胞质呈棕黄色或棕褐色为阳性细胞。

1.6 镜下观察。

400倍光学显微镜下每张切片随机观察5个不重叠视野，计数阳性细胞数，取平均值。

1.7 统计学处理。

所有实验数据均用x±s表示，采用SPSS 11.0统计软件进行方差分析和t检验。

2 结 果。

2.1 TUNEL染色原位细胞凋亡检测结果。

见表1和图1。随着再灌注时间的增加，缺血再灌注组凋亡细胞逐渐增多（P＜0.05）；再灌注各时间点，与缺血再灌注组相比，川芎嗪治疗组凋亡细胞数明显减少 (P0.01)。表1 各组凋亡细胞表达（略)。

2.2 免疫组化染色检测bcl2表达情况。

见表2和图2。随着再灌注时间的增加，缺血再灌注组bcl2阳性细胞逐渐减少（P＜0.05）；再灌注各时间点，与缺血再灌注组相比，川芎嗪治疗组bcl2阳性细胞数明显增加(P0.05)。表2 各组bcl2蛋白表达（略)。

3 讨 论。

缺血再灌注损伤的神经保护是目前国内外研究的热点。急性缺血性脑梗死的治疗主要是溶栓和神经保护相结合。溶栓在治疗疾病的同时，也不可避免地引起再灌注损伤。如何最大限度减少再灌注损伤，更好地保护已经受损的神经细胞成为急需解决的问题。寻找研发一种有效、平稳、安全的神经保护药物为解决这一问题提供了契机。以往的神经保护药物作用机制/靶点单一、副作用大、价格昂贵等原因，限制了其在临床的应用。祖国的传统医学具有整体观念的特点，中药又具有复方特征，可以作用于多靶点，而且中药来源广泛、价格低廉。鉴于此，越来越多的研究者把目光投向了传统中药。