异基因造血干细胞移植后人类巨细胞病毒pp65的监测及疗效、危险因
作者：贾晋松，刘东平，黄晓军，吴彤，刘代红，张耀臣，苏宏，王静波，
周葭蕤，刘强，殷宇明，孙瑞娟，段萱，陆道培。
【摘要】 本研究探讨异基因造血干细胞移植(allo HSCT)后受者外周血白细胞巨细胞病毒(CMV) pp65抗原阳性细胞数的变化及临床意义。以104例HSCT受者为研究对象，采集移植前后及恢复期受者的抗凝血标本，用CMV pp65单克隆抗体荧光免疫组织化学法检测CMV早期抗原，并进行动态观察。结果表明： 104例HSCT受者中29例移植后检出CMV pp65抗原阳性，检出率27.88%，其中16例为CMV血症，13例为CMV病。29例经抗病毒治疗后25例抗原转为阴性，有效率86.21%，死亡4例，病死率13.79%。CMV感染患者中，受非血缘或单倍体相合异基因HSCT的患者与受同胞全相合异基因HSCT的患者CMV感染率分别为39.29%和14.58%，两者相比较有显著性差异(P＜0.05)。0—Ⅰ度急性GVHD组CMV感染的发生率为19.44 %，而Ⅱ—IV度急性GVHD 组为46.88%，两者间的差异有显著意义(P＜005)。CMV抗原阳性与阴性患者的急性GVHD发生率有显著性差异(P＜005)。结论： 外周血白细胞CMV pp65病毒抗原检测可作为造血干细胞移植后CMV病的监测指标，用于指导移植后抗病毒的治疗和疗效评价。
【关键词】 造血干细胞移植； 巨细胞病毒； pp65抗原； 荧光免疫组织化学测定。
Survellance of Cytomegalovirus for Antiviral Efficacy and Risk Factors in Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation。
Abstract The study was aimed to investigate the pp65 antigen of human cytomegalovirus (CMV) and its clinical significance in patients revived allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). 104 patients received allogeneic HSCT were studied. Anticoagulant blood samples were obtained from the recipients before and after transplantation and in the convalescence. CMV pp65 antigen in leukocytes was detected by indirect immunoflurescence assay using CMV Brite Kit weekly. The results showed that among the 104 patients，29 cases were CMV pp65 positive (27.88%). Out of 29 cases 16 were CMV antigenemia and 13 cases were CMV disease. There were 25 cases who positively responded to antiviral therapy (effective ratio 86.21%) and 4 cases died (case—fatality ratio 13.79%). The detection revealed a significant difference in the incidence of CMV infection between the patients received unrelated or haploidentical family donor HSCT (39.29%) and HLA—identical sibling donor HSCT (14.58%) (P0.05). The incidence rate of CMV infection in patients with 0—Ⅰ grade aGVHD and patients with Ⅱ—IV grade aGVHD were 19.44% and 46.88% respectively，which had significant difference (P＜0.05)。There was significant difference in the occurance of aGVHD between the patients with and without positive CMV pp65 (P0.05). It is concluded that infection of CMV can be detected by the CMV pp65 monoclonal fluorescence immunohistochemistry，The detection of CMV pp65 antigen in peripheral blood leukocytes as a indicator for CMV disease survellance after HSCT，which may be used to early diagnose the CMV infection，to guide the antiviral treatment and evaluate its efficacy.
Key words hematopoietic stem cell transplantation; cytomegalovirus; pp65 antigen; fluorescence immunohistochemistry assay。
异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoie—tic stem cell transplantation，allo—HSCT)后人类巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)感染是主要的感染合并症及死亡原因［1］。因此，对allo HSCT后CMV活动性感染进行监测和防治甚为重要。早期诊断、早期治疗是预防移植后CMV病发生和减少因CMV感染而致死亡的关键措施。外周血白细胞CMV pp65抗原的检测是诊断CMV感染的早期、快速和敏感的方法，可以指导移植后预防性抗CMV治疗，监测抗病毒治疗疗效［2］。本研究采用CMV pp65单克隆抗体免疫荧光测定法和聚合酶链反应(PCR)法，对104例异基因造血干细胞移植的患者做了连续性监测和分析，以研究移植后抗病毒治疗中CMV抗原阳性细胞数的变化并探讨其在监测CMV感染中的意义。
材料和方法。
病例选择。
104例患者均为2004年3月至2005年3月在我院进行造血干细胞移植者，其中男64例，女40例，平均年龄27.2 岁，年龄范围5—50岁，其临床特点见附表。
预处理方案和移植物抗宿主病的预防。
预处理方案采用改良马利兰/环磷酰胺(Bu/Cy)方案，个别患者采用环磷酰胺和全身照射(CTX/TBI)为主的预处理方案。移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)预防采用经典环孢菌素A 联合短程甲氨蝶呤方案。
CMV感染的分类和定义［3］。
CMV活动性感染 血中出现CMV pp65抗原阳性白细胞（诊断标准： CMV pp65阳性细胞 1 / 1×105 WBC［4］），即出现CMV 抗原血症，包括无症状感染和CMV病。
CMV无症状感染者。
仅CMV pp65抗原血症阳性，而无临床表现者。CMV病 CMV pp65抗原血症出现于7天内，若体温≥37.8℃持续3天以上者并出现下列二项者可诊断为CMV病： ①白细胞计数≤3.0×109/L，无其他原因可解释者；②不典型淋巴细胞增多，异常淋巴细胞10%；③呼吸困难或间质性肺炎(interstitial pneumonia，IP)胸片证实，而无其他原因者；④肝炎(肝功能异常、肝脾肿大)；⑤腹痛、胃肠道出血；⑥视网膜炎；⑦移植物植入不良。Table . Patient characteristics（略）。
CMV 感染的防治。
预防方案。
对全部异基因HSCT患者应用更昔洛韦(ganciclovir，DHPG) 及大蒜素预防CMV感染。DHPG剂量为10 mg/（kg·d），于移植前第9天至移植前第2天每天分2次静脉滴注。大蒜素剂量为1 mg/（kg·d）于移植后1—30天给予静脉滴注；中晚期给予口服大蒜素。
治疗方案 一旦确诊CMV 活动性感染立即给药。开始为诱导治疗，DHPG剂量为10 mg/（kg·d），分2 次静脉滴注，持续2—3周。若病情好转则转为维持治疗，每日剂量不变，但每周用药5天，再持续2—3周，必要时亦可适当延长。可联合静脉输注免疫球蛋白500 mg/kg，隔日1次，连续2 周。若DHPG造成严重白细胞减低或疗效不显著时则换用膦甲酸钠 (foscarnet) 120—180 mg/（kg·d)静脉点滴。对前者，白细胞上升超过1.5×109/L时可换用DHPG。对重症者，DHPG与膦甲酸钠联合使用或DHPG、膦甲酸钠和免疫球蛋白三药联合应用。以上治疗同时均加用大蒜素1 mg/（kg·d），静脉滴注。
CMV检测。
标本收集。
自预处理开始每周对患者EDTA抗凝外周血血标本进行CMV pp65及CMV—PCR动态检测，直至出院。
试剂。
CMV Brite 免疫荧光抗原血症试剂盒为荷兰ＩＱ公司产品(购自深圳晶美生物工程有限公司)，CMV抗原阳性和阴性对照玻片由试剂盒提供。
CMV pp65荧光免疫组织化学法检测 ①分离白细胞：取EDTA抗凝血5 ml，采用右旋糖酐（分子量为20万）沉降法分离白细胞；②调整细胞浓度：用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)调整细胞浓度为1.5×106/ml；③制备细胞涂片；④固定和破膜；⑤免疫荧光染色：加抗pp65混合单克隆抗体(C10/C11，1∶100稀释)，PBS洗涤晾干后加入 FITC标记的羊抗小鼠IgＧ，置于湿盒中，37℃温育30分钟，PBS洗涤后镜检；⑥读片和结果判断：用荧光显微镜观察结果，在镜下观察全部细胞，pp65阳性细胞呈均匀的绿色/黄绿色，圆形/多叶的核染色（图1）。
CMV—PCR 检测。
采用华美生物工程公司生产的40℃ PCR检测试剂盒检测血浆及尿的CMV—DNA。样本的采集：取静脉血1 ml，EDTA抗凝，离心制备血浆。同时取晨尿5 ml，离心取沉渣。
统计学分析。
所有数据采用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理，CMV感染的累计发生率用Kaplan—Meier曲线表示，曲线间的比较用log—rank检验（曲线无交叉）或Breslow检验（曲线交叉）；多因素分析用Cox回归分析。组间CMV感染率分析采用χ2 检验。以P=005为检验水准，P005为差异显著。
结果。
CMV感染发病情况。
104例患者造血干细胞移植术后发生活动性CMV感染者共29例，发生率27.88%。本组病例中一部分为同时采用CMV pp65荧光免疫组织化学法及PCR法检测，前者的阳性率为26.81%（26/97），后者的阳性率为34.38%（11/32），两者的符合率为86.21%。29例CMV感染者中单纯CMV血症16例，占总感染人数的55.17 %；出血性膀胱炎6例，占20.69 %；间质性肺炎4例，占13.79 %；CMV肠炎3例，占10.34 %。HSCT后发生巨细胞病毒感染的时间在2—4个月，且移植后第30至70天为CMV感染的高峰期，其中≤50天出现阳性者15例，占51.72% (附表、图2)。
CMV感染患者中，非血缘及单倍体相合异基因HSCT患者（22例，皆使用ATG）与同胞HLA相合异基因HSCT患者（7例，未使用ATG）的CMV感染率分别为39.29%和14.58%，两者相比较有显著性差异(P＜0.05)。而单倍体相合异基因HSCT的患者与非血缘异基因HSCT患者CMV感染率分别为4043%和37.50%，两者相比较无明显差异(P＞005)。骨髓造血干细胞移植、外周血干细胞移植和骨髓加外周血干细胞移植的CMV感染发生率分别为11.11%、26.09%和30.56%，三者之间相比较无显著性差异 (P＞0.05)。
29例CMV pp65抗原阳性患者中有23例发生GVHD (79.31%)，而75例抗原阴性者仅6例发生GVHD (8%)，抗原阳性与阴性患者的GVHD发生率有显著性差异 (P＜0.05)。0—Ⅰ度急性GVHD组CMV感染的发生率为19.44 %，而Ⅱ—IV度急性GVHD 组为46.88%，两者间的差异有显著性(P＜0.05) (图3)。
CMV感染患者在应用大蒜素基础上，根据病情19例接受更昔洛韦加丙种球蛋白治疗，18例患者经治疗后抗原血症转阴，同时症状消失，1例因治疗无效合并细菌和真菌感染而死亡，有效率为94.74%；膦甲酸钠治疗5例，有效4例 (80%)；DHPG + 膦甲酸钠治疗5例，有效3例 (60%)；三者之间比较可能由于病例较少未见明差异 (P＞0.05)。CMV活动性感染患者抗病毒药物治疗的总有效率为8621%（25/29）。16例病毒血症15例转阴，转阴率为93.75%；4例间质性肺炎中1例治愈；3例CMV 肠炎中2例痊愈；6例出血性膀胱炎中治疗全部有效。
CMV感染的相关危险因素。
104例患者中死亡13例，CMV感染致死占死亡原因的首位，为所有死亡的30.77% (4例)。非血缘及单倍体相合供者、应用抗淋巴细胞球蛋白（ATG）、 Ⅱ—Ⅳ度急性移植物抗宿主病（GVHD）是CMV 感染的相关危险因素，其他因素如年龄、性别、疾病种类、移植前CMV 感染状态、预处理方案与CMV 感染均无显著相关性。
讨论。
患者在异基因造血干细胞移植后由于免疫功能缺陷，CMV特异性细胞毒T细胞和辅助T细胞反应缺乏，不能清除感染和产生免疫保护，致使体内潜伏病毒复燃或经输血或供者细胞感染CMV病毒，因此容易发生CMV活动性感染 ［4］。早期检测CMV对指导临床治疗、提高移植后长期生存率有重要意义。CMV pp65是在病毒复制早期出现的抗原，在抗原阳性的多形核细胞中含量丰富。因此，外周血白细胞感染的CMV pp65抗原检测是一种诊断和监测器官和骨髓移植病人CMV活动性感染的强有力的工具。与病毒分离比较，通过检测CMV pp 65抗原血症来判断体内有无活动性CMV感染的敏感性和特异性均在95%以上［5］。CMV有着广泛的嗜细胞性，特别是血管内皮细胞、外周血中的白细胞等极易受到其侵袭，在活动性CMV感染时，外周血中的白细胞以主动或被动的方式从血管内皮细胞等获取大量的病毒抗原，因此只要能在外周血中检出含有CMV pp65抗原的白细胞，即可诊断为活动性CMV感染，而且敏感性和特异性高。不仅如此，CMV pp65阳性白细胞的数目还可以反映受者体内病毒的负荷，能体现CMV感染的严重程度、抗病毒治疗效果以及感染的预后。本研究显示，检测CMV pp65抗原血症与血浆CMV—PCR的结果基本一致。因此，在移植后监测CMV pp65抗原，完全可以作为活动性CMV感染的诊断指标。目前，抗CMV病的重点是预防性抗病毒治疗，抢先（preemptive）治疗是指检测到CMV亚临床感染的证据或针对CMV感染高危者进行的抗病毒治疗。而早期检测到活动性CMV感染是抢先治疗的先决条件。
CMV感染及其所致的间质性肺炎是导致移植后患者死亡的重要原因之一。近年来，随着早期诊断和防治方法的进步，CMV感染的预后已显著改善。抗病毒药物如DHPG、膦甲酸钠、西多福韦(cidofovir)的临床应用，使得移植后患者CMV病发病率和死亡率显著下降［6—8］。Reusser等［6］报道，在EBMT (欧洲外周血与骨髓移植协作组) 进行的DHPG和膦甲酸钠治疗移植患者CMV感染的随机对照研究中，DHPG与膦甲酸钠的疗效无显著差异。本研究中两组病例虽较少，但结果与之相似，DHPG与膦甲酸钠治疗的有效率无明显差异。DHPG与膦甲酸钠联合使用可更有效地治疗高负荷病毒感染的患者 ［9］，西多福韦一般是DHPG与膦甲酸钠治疗失败时的二线用药［10］。大蒜素具有抗CMV作用，陆道培等［11］在国内外首先证实大蒜中有抗巨细胞病毒成分，并首先用于防治造血干细胞移植后间质性肺炎。本研究中的病例在应用大蒜素基础上使用更昔洛韦等防治CMV感染亦取得了较好的效果。
104例移植受者中29例发生CMV感染，DHPG加丙种球蛋白早期干预性治疗16例，15例病毒血症转阴，转阴率为93.75%，仅1例发展至CMV病。对确诊的CMV—IP，大剂量免疫球蛋白 ( 500 mg / kg，隔日1次)能够增强抗病毒治疗的效果，而且开始治疗时间要早、初始用量要大，待症状有明显改善后才可逐步减量，这样可使间质性肺炎的病死率明显降低［12］。根据本研究资料，对CMV阳性而无临床症状者进行干预性治疗可使CMV转阴，减少CMV病的发生，有效地降低死亡率。对于伴有严重GVHD、在常规预防GVHD的基础上加用其它免疫抑制剂以及大量输血的患者，采用干预性治疗尽快使CMV血症转阴的必要性更大。
本研究资料为首次报告有关单倍体相合异基因HSCT患者CMV的感染情况，非血缘及单倍体相合异基因HSCT患者与同胞HLA相合异基因HSCT患者CMV感染率有显著性差异，因此ATG很可能是发生CMV感染的一个重要危险因素。ATG是异基因造血干细胞移植应用的重要的免疫抑制剂，非血缘及配型不相合的患者在移植过程中均需使用ATG。但ATG的体内去T细胞作用使受者免疫功能在移植过程中更为低下，免疫恢复的时间更长，CD4+T细胞数量减少，因而更易发生CMV感染［13］。
GVHD与CMV感染关系复杂，急性GVHD增加了发生CMV病的危险，是影响CMV感染发生的重要因素［8］。GVHD越严重，CMV感染的机率越大。Meyers等［14］报道，造血干细胞移植后0—Ⅰ度GVHD的患者CMV感染率为42.1%，Ⅱ—Ⅳ度GVHD 患者感染率为63.1%。本研究结果与其相似，急性GVHD可明显增加CMV感染的发生率，且随着GVHD的程度加重感染率有所增高。患者发生GVHD后大量应用免疫抑制剂可进一步减弱HSCT患者尚未恢复的免疫力，另外GVHD本身也能够明显地减弱患者的免疫功能，进而导致CMV的激活。因此有效地预防GVHD可以减少CMV感染的发生，在治疗上必须同时兼顾二者。
CMV活动性感染是造血干细胞移植患者的重要并发症和首位死亡的原因。随着检测手段的不断进步，如CMV—PCR、CMV pp65单克隆抗体荧光免疫组织化学法、NASBA（the nucleic acid sequence—based assay）等项目开展使得更为准确地检测CMV和早期诊断CMV感染成为可能。CMV pp65抗原检测在指导预防性抗病毒治疗方面起到重要作用［8］。本研究提示，人类CMV pp65白细胞病毒抗原检测，即CMV pp65阳性可作为造血干细胞移植并发CMV病的诊断依据，它有助于早期、准确地发现CMV感染，为早期治疗提供依据，指导移植后的抗病毒治疗及疗效评价。
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