芪芍合剂对关节炎大鼠炎症及血管新生相关因子的影响
作者：沈维干， 薛永骥， 张育， 孟德钎， 顾健。
【摘要】 目的研究中药组方芪芍合剂对大鼠II 型胶原诱导型关节炎(CIA)炎症及血管新生相关因子的影响。方法用II 型胶原和完全弗氏佐剂建立CIA 模型，造模次日始用芪芍合剂(40 g·kg—1·d—1×4周)灌胃，模型对照组分别给予等量的生理盐水。于造模第4周大鼠心脏采血分离血清进行Western Blot 检测大鼠体内IL—1β，TNFα，VEGF，MMP—2以及MMP—9的相对表达水平。结果中药可以降低大鼠IL—1β，TNF—α，VEGF ，MMP—2，MMP—9 的表达。结论IL—1β，TNFα，VEGF ，MMP—2，MMP—9 共同促进CIA 大鼠炎症的形成和发展，中药可能通过抑制它们的表达而发挥抗炎及抗血管新生作用。
【关键词】 芪芍合剂 关节炎 II型胶原诱导型 血管新生 相关因子 大鼠。
类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种常见的可致残的慢性炎症性疾病，与多种免疫失调密切相关。我国患病率为0.32%～0.36%。RA主要病理特点是在炎症刺激下，关节滑膜细胞增生，衬里层增厚，多种炎细胞浸润，滑膜细胞合成TNF—α，IL—1等多种细胞因子促进滑膜成纤维细胞增殖和微血管新生而形成血管翳，后者从滑膜边缘逐渐扩展覆盖于关节软骨表面，一方面中断了关节的营养，另一方面通过分泌一些酶导致软骨和骨质的破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。 本研究采用中药组方芪芍合剂治疗用Ⅱ 型胶原和完全弗氏佐剂(CFA)构建CIA 大鼠模型，4周后用Western Blot 的方法分别检测各组大鼠血清中TNFα，IL—1β，VEGF，MMP—2，MMP—9因子的水平。研究中药组方对RA 的炎症及血管新生相关因子影响。
1 材料。
1.1 药物芍合剂由桂枝芍药知母汤和黄芪桂枝五物汤加减组成：黄芪30 g，当归10 g，川芎10 g，白芍15 g，丹参15 g，桂枝10 g，知母10 g ，秦芎10 g，桃红10 g，牛膝10 g，白芥子10 g，甘草10 g等，水煎后浓缩至4 g·ml—1生药，4℃ 保存备用。
1.2 动物雌性近交系SD 大鼠，清洁级，4～6周龄，平均体重为（190±15）g，购于南京医科大学实验动物中心(合格证号：苏动质字第97001号)。
1.3 试剂Ⅱ型胶原(上海本草生物医学工程研究所产品)，卡介苗（BCG）(兰州生物制品所产品)，高、低分子量标准蛋白参照物(上海华舜生物工程有限公司产品)，TNFα，IL—1β，VEGF，MMP—2，MMP—9兔抗多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司产品），羊抗兔AP 多克隆抗体(工作浓度为1∶1 000) （武汉博士德生物工程有限公司产品）。
2 方法。
2.1 II型胶原的配制取液体石蜡8 ml 和羊毛脂4 ml混匀高压灭菌。加入卡介苗（BCG）120 mg，混匀。将II型胶原60 mg溶于12 ml 的0.01 M 乙酸中，浓度为5 mg·ml—1，4℃ 过夜，充分溶解，然后和完全弗氏佐剂（CFA）等体积混合，乳化，制成Ⅱ型胶原乳剂24 ml，每毫升含5 mg BCG和2.5 mg II 型胶原。
2.2 实验动物的分组取40只大鼠，随机分为4 组：A组：模型组； B组：模型+ 生理盐水组； C组：模型+中药组； D组：生理盐水造模对照组（正常对照组）。
2.3 动物模型的建立以每只0.1 ml的剂量在鼠的右后足跖皮内注射(II 型胶原每只0.25 mg)。21 d时以每只0.1ml的剂量尾根部皮内多点激发注射1次。对照组以生理盐水注射，方法同模型组。所有动物均在清洁环境中饲养。
2.4 中药治疗参照文献［1,2］于造模第2天，B 组予生理盐水灌胃；C 组采用中药灌胃，用药剂量按“动物体表面积比率换算等剂量法”，由正常人每日常用剂量换算得出：40 g·kg—1，1次/d，共4 周。大鼠于第4周心脏采血2 ml，室温静置1 h，4℃ 以3 000 r/min，10 min，取上清，分装，—80℃冻存。
2.5 Western Blot 检测大鼠血清用Lowry‘s法测定蛋白含量，按每孔40 μg·20 μl—1上样，经12% 十二烷基硫酸钠(SDS)—聚丙酰胺凝胶电泳分离, 冰浴中以260 mA 电转70 min，转到PVDF膜, 3% BSA 室温封闭1 h, 一抗（抗TNF—α，IL—1β，VEGF，MMP—2，MMP—9抗体）为兔抗多克隆抗体（工作浓度均为1∶200），4℃孵育过夜，二抗为羊抗兔AP 多克隆抗体（工作浓度为1∶1 000），室温孵育2 h，将PVDF 膜浸入显色液显色待条带清晰时终止显色，晾干，扫描。
2.6 统计学处理所有统计均在SPSS 12.0 及Excel 2003 软件中完成，以P0.05 为有显著性差异。PVDF膜经扫描成像后用GIS 凝胶图象处理系统对TNF—α，IL—1β，VEGF，MMP—2和MMP—9条带进行半定量分析，以对照组（D 组）条带为标准(100)，各组条带密度分析所得值与对照组（D 组）之间采用单样本检验（One—Sample Test）, 各模型治疗组与模型组（A组）之间多样本方差分析（One—Way ANOMA）进行统计学处理。
3 结果。
造模大鼠饮食及活动减少，后期可见毛发枯燥无光泽、负重困难、关节活动障碍等，中药治疗组的上述表现较轻。模型组大鼠造模后第3天陆续出现注射足踝、趾、膝关节淤斑、红肿及轻度肿胀，于第7～10天开始红肿加重，关节表面皮肤发亮充血，部分大鼠向对侧后肢及双前肢蔓延，部分大鼠可在耳廓或尾部扪及皮下结节，在第21天加强免疫后上述症状进一步加重，但中药治疗组没有模型组明显。A、B、C组各有1只大鼠死亡。