白刺总黄酮对血管内皮细胞损伤的保护作用的研究
作者：张义军 樊莲莲 张永军 李连疆 邓峰美 唐克 韩荣。
【摘要】 目的研究白刺总黄酮对血管内皮细胞损伤的保护作用及机制。方法用过氧化氢（H2O2）诱导血管内皮细胞损伤,用酶标仪检测细胞内一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—Px）以评价氧化的程度。结果不同浓度的白刺总黄酮可促进受损的内皮细胞修复，同时提高SOD、NOS、GSH—Px活力和NO水平。结论白刺总黄酮具有保护血管内皮细胞损伤的作用，其机制可能与其抗氧化作用有关。
白刺为我国的特有种，在新疆干旱地区分布广泛，其果实中含有丰富的营养成分和活性物质，可入药，具有调经活血，消食健脾等功效。课题组对白刺总黄酮进行分离发现含有槲皮素、山萘酚、异鼠李素等黄酮单体化合物，它们都具有一定的抗氧化能力［1～3］。总黄酮与其单体化合物进行对比抗氧化能力强弱尚未见报道。内皮细胞损伤直接或间接的反应氧化程度，同时内皮细胞损伤是动脉硬化发生的始动环节［4］。因此本实验利用体外细胞培养方法，用H2O2诱导HUVEC损伤，槲皮素做阳性对照，研究白刺总黄酮对HUVEC损伤的保护作用及可能机制。
1 材料 0.1%Ⅰ型胶原酶(武汉博士德生物工程有限公司)；PBS（Phosphate Buffered Saline）;缓冲液(JMF—0006天津津脉) ;胎牛血清(CHARACTERIZED公司) ;SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20080626);GSH—Px试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20080626); NO试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20080626 ); NOS 试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20080626 ); TDL—5000低温冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂); PufferHubbard超低温冰箱(美国HARRIS公司);XW —80A旋涡混合器(上海精科实验有限公司);电热恒温水浴锅(北京泰克仪器有限公司);超净台(ZHJH—1112B苏州公司) ；CO2 孵箱(Thermo Formo公司) ； 双向磁力搅拌器(79—2 江苏金坛市医疗仪器厂)；电子分析天平(AE—200 上海梅特勒—托利多仪器有限公司)；倒置相差显微镜(BDS200—PH奥特光学 OPTEC)； 酶标仪(SN—3001 Thermo Formo公司)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG—9240 上海齐欣科学仪器有限公司)；立式电热压力蒸气灭菌器(LDZX—30FBS 上海申安医疗器械厂)。
2 方法。
2.1 白刺总黄酮的制备取白刺果，75%乙醇进行连续回流提取4次，每次加75%乙醇7倍量回流2 h，分别过滤浓缩至浓膏无醇味，用2.5％碳酸钠(pH8)溶解浓膏,过滤；过滤液用50%盐酸调至pH为5,过滤得沉淀用水洗至中性，烘干。利用聚酰胺柱层析分离得白刺总黄酮。对其用Sephadex LH—20进行分离纯化得槲皮素［5］。
2.2 HUVEC的培养及分组 HUVEC的原代培养:按文献［6］报道以及在实验中的摸索对方法行进了改进。2007—10～2008—04,在我院妇产科产婴室收集健康胎儿脐带20～40 cm,用0.1%胶原蛋白酶得到人胎儿脐静脉内皮细胞。培养于ECM培养液中,置于37℃下5%CO2培养箱中。进行培养传到第3代用于试验。实验分正常对照组、阳性对照组（加75μmol/L H2O2＋槲皮素80 μmol/L）、模型组(仅加75μmol/L H2O2)和白刺总黄酮低、中、高3个剂量组(均加75 μmol/L H2O2及分别加20 μmol/L白刺总黄酮、40 μmol/L白刺总黄酮、80μmol/L白刺总黄酮),每组6例。 将2×104个/孔HUVEC接种6孔板,在上述条件下孵育24 h，分别加入上述浓度的槲皮素和白刺总黄酮，各组细胞孵育24 h，然后除正常对照组外加入75μmol/L H2O2诱导损伤，继续培养4 h后终止培养，进行有关指标的测定。
2.3 检测方法NO，NOS，SOD，GSH—Px的具体测定方法参照试剂盒说明书进行。
3 结果。
3.1 白刺总黄酮对受损内皮细胞NO含量和总型NOS、结构型NOS活力的影响NO不仅能调节血管舒张，还是一种重要的抗炎分子,NO减少可以加速内皮细胞损伤［7］。从测定数据显示，模型组与正常对照组比较有显著性差异（P0.01），表明H2O2诱导内皮细胞受损模型复制成功；从各组的NO水平可看出模型组比阳性对照组有明显降低（P0.05），不同剂量的总黄酮组随着浓度的升高NO的浓度也升高，与相同剂量的阳性对照组比虽没有统计学意义但数值相对较高。 NOS催化L—Arg和分子氧反应生成NO，NOS即为总型NOS(TNOS)主要有两种类型：即结构型（cNOS)和诱导型（iNOS)，cNOS主要分布在神经元和内皮细胞内。从各组的NOS活力水平可看出模型组比阳性对照组明显降低（P0.01），不同剂量的总黄酮组随着浓度的升高cNOS活力也升高，与相同剂量的阳性对照组比活力相对较高，高剂量黄酮组cNOS活力比正常对照组虽也没有统计学意义但活力也相对较高。见表1。
表1 白刺总黄酮对受损内皮细胞NO含量和TNOS、cNOS活力的影响（略）。
与正常对照组比较，***P0.001,**P0.01；与模型组比较，△P0.05，△△P0.01； 与阳性对照组比较，为#P0.5 ；n=6。
3.2 白刺总黄酮对受损内皮细胞SOD、GSH—Px活力的影响超氧化物歧化酶（SOD）对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用。从各组的SOD活力水平可看出模型组比阳性对照组有极明显降低（P0.001），表明H2O2诱导内皮细胞受损对SOD活力影响较大，不同剂量的总黄酮组随着浓度的升高SOD活力也升高，与相同剂量的阳性对照组比活力相对较高。黄酮高、中剂量组与模型组对比明显使SOD活力增高。