人参皂苷Rb1与芳维甲酸乙酯对光老化皮肤真皮成纤维细胞基质金属
作者：程基焱， 刘国红， 黄吉春， 余鸿， 刘广益。
【关键词】 人参皂苷Rb1；,,芳维甲酸乙酯；,,基质金属蛋白酶；,,成纤维细胞；,,免疫组织化学。
摘要：目的通过人参皂苷Rb1与芳维甲酸乙酯对皮肤真皮体外培养光老化成纤维细胞胞质内基质金属蛋白酶表达的影响，阐明人参皂苷Rb1对光老化的防治机理，探索光老化的防治手段。方法建立体外培养真皮成纤维细胞光老化模型，用人参皂苷Rb1与芳维甲酸乙酯进行干扰，免疫组织化学技术显示基质金属蛋白酶的表达的改变。结果人参皂苷Rb1与芳维甲酸乙酯对培养成纤维细胞胞质基质金属蛋白酶的表达有显著抑制作用（P0.05）；人参皂苷Rb1和芳维甲酸乙酯对其表达的抑制作用相互之间差异无显著性(P0.05)。结论人参皂苷Rb1对光老化成纤维细胞具有与芳维甲酸乙酯相似的防治作用，其机理与芳维甲酸乙酯的作用机理可能相同或者相似，及通过调节MMPs活性防治皮肤光老化。
关键词：人参皂苷Rb1； 芳维甲酸乙酯； 基质金属蛋白酶； 成纤维细胞； 免疫组织化学。
Comparative Study of the Effect of the Ginsenoside Rb1 and Arotinoid Ethyl Ester on the Expression of MMPs in Sun—induced Aging Dermis Fibroblasts。
Abstract：ObjectiveTo explore the methods of prevention and cure of sun—induced aging dermis, and clarify the mechanism of Ginsenoside Rb1 on sun—induced aging dermis, with the study of expression of matrix metallo preteinases in sun—induced aging dermis fibroblasts‘ cytoplast, which are cultured in vitro, under the effect of Ginsenoside Rb1 and arotinoid ethyl ester. MethodsBuild the dermis fibroblasts sun—induced aging model, and affect the cells with Ginsenoside Rb1 and arotinoid ethyl ester, and display the change of expression of matrix metallo preteinases with immunohistochemistry. ResultsGinsenoside Rb1 and arotinoid ethyl ester had significant inhibition effect on the expression of matrix metallo preteinases in the fibroblasts‘ cytoplast cultured in vitro（P0.05）; the inhibition roles of Ginsenoside Rb1 and arotinoid ethyl ester on the expression of matrix metallo preteinases were not significant(P0.05). ConclusionGinsenoside Rb1 has effect of prevention and cure of sun—induced aging dermis‘s fibroblasts like the arotinoid ethyl ester, and its mechanism is the same as or like the arotinoid ethyl ester through regulating the expression of matrix metallo preteinases.
Key words：Ginsenoside Rb1; Arotinoid ethyl ester; Matrix metallo preteinases; Fibroblast; Immunohistochemistry 皮肤老化是人体衰老的主要表现之一，也是目前人们极为关注的话题。长期反复的紫外线照射是皮肤光老化的重要因素，皱纹形成是皮肤光老化的最为重要特征。研究皱纹形成机理对防治紫外线辐射损伤及皮肤老化有重要意义。维甲酸对光老化皮肤的治疗作用已经被大量的研究所证实，并且已经应用于临床，但有研究表明维甲酸虽然已经经历了几代，仍然有许多很难克服的毒副作用［1~3］。人参具有保护机体细胞和全身免受应激的影响，降低血糖和血胆固醇，促进新陈代谢等功能，目前已经广泛应用于临床的许多方面，包括在很多皮肤保健品和化妆品内［4，5］。本研究通过用人参的有效成分之一―人参皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1）与芳维甲酸乙酯（arotinoid ethyl ester）的对比研究，目的在于阐明人参皂苷Rb1防治光老化的可能机理，探索更为有效的皮肤光老化的防治方法。基质金属蛋白酶(matrix metallo preteinases,MMPs)在各种生理、病理条件下细胞外基质降解和重塑中起着关键作用，可以降解含或不含胶原成分的皮肤真皮细胞外基质。有研究表明，在在体实验和细胞培养实验中， MMPs在衰老皮肤真皮成纤维细胞（fibroblast；FB）的表达明显增强，说明其在衰老发生及皱纹形成过程中有重要作用，尤其是MMP1和MMP3［6，7］。在本研究中选择MMP1和MMP3作为光老化皮肤真皮的老化程度指标进行研究。
1 材料与方法。
1.1 取材健康新生儿包皮真皮。
1.2 主要仪器设备与试剂芳维甲酸乙酯（购于市场），溶于吐温20 (山西省天星生化药业有限公司)；人参皂苷Rb1（中国医科大学化学教研室），溶于二甲基亚砜；MMP1和MMP3免疫组织化学试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；8甲氧补骨脂素(8MOP)；四唑盐(MTT)试剂；等。紫外线功率测定仪（上海西格玛高技术公司）；二氧化碳培养箱；长波紫外线（UVA）灯管；等。
1.3 细胞培养及分组处理细胞培养、细胞复苏、细胞传代等实验方法，细胞接受紫外线照射、8MOP、芳维甲酸乙酯、人参皂苷Rb1等药物处理等实验方法，确定无毒性紫外线照射剂量、8MOP、芳维甲酸乙酯、人参皂苷Rb1等药物的最佳作用浓度、选择作用时间等实验方法，完全参照文献［8］进行。具体分组及各组处理方法：正常对照组（control group；CG）；阳性对照组（masculine group；MG）：UVA+8MOP；维甲酸实验组（arotinoid ethyl ester treatment group；AG）：UVA+8MOP+芳维甲酸乙酯；人参皂苷Rb1实验组（Ginsenoside Rb1 treatment group；GG）：UVA+8MOP+人参皂苷Rb1。人参皂苷Rb1剂量为20，50，100 μg/ml（分别为GG1，GG2，GG3三组），作用时间为48 h。
1.4 免疫组织化学实验SABC法显示各组MMP1和MMP3。步骤：中性甲醛固定培养细胞20 min→Triton—100打孔→3%双氧水灭活内源性酶7 min，蒸馏水洗→抗原修复液修复抗原，水洗→滴加正常山羊血清→滴加一抗（1∶200）孵育，pH7.3、0.01M PBS洗→滴加二抗（1∶100）孵育，PBS洗→DAB避光显色，镜下控制显色时间→蒸馏水终止显色，充分洗脱→脱水，封片［8］。
1.5 结果观察与图像分析用光学显微镜对各组切片进行形态学观察，并采用盲法用IS4400图像分析仪，在400倍下进行图像分析。检测：(1)光密度（反映染色深浅）；(2)阳性反应区域与阴性反应区域比值(PNarea；PNarea与反应的强度无关，代表阳性着色颗粒的相对面积，可以反映阳性率)。均用±s表示。
1.6 统计学分析对以上结果用SPSS10.0 For Windows方差分析进行统计学检验，再用SNK q法进行组间比较。