中药逆转肿瘤多药耐药的分子生物学机制实验研究进展
【摘要】 总结了近年来中药逆转多药耐药的分子生物学研究的实验概况，从逆转多药耐药的经典、非经典及多靶点作用的角度阐述了中药的逆转作用，认为其主要是通过下调P—gp蛋白及调控MRP、LRP、拓扑异构酶、谷胱甘肽S转移酶、核转录因子、Ca2+浓度、凋亡相关基因等介导的多药耐药而实现，其作用多不局限于单一机制，而与其多靶点作用有关。
目前，化疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，而在化疗过程中易产生肿瘤的多药耐药，大大降低了其疗效。因此，如何解决多药耐药就成为了提高化疗疗效，改善患者生活质量的关键问题。多药耐药(multidrug resistance,MDR)是一个多基因参与的过程，涉及多种耐药相关蛋白［1］。不同肿瘤具有不同的耐药表型，可以是某种耐药基因表达，也可能是多种耐药基因同时表达的结果，而由于中药的多靶点作用，其可通过作用于多个耐药相关蛋白达到逆转多药耐药的作用。目前，中药抗多药耐药的作用研究已深入到分子水平。本文概述近年来中药在逆转多药耐药的分子水平的研究进展。
1 肿瘤多药耐药经典途径 P—gp蛋白介导的多药耐药是研究最多，机制最为明确的多药耐药产生途径，因此被称为多药耐药的经典途径。由MDR1基因编码的P—gp蛋白ATP依赖性的药物泵，其是通过水解ATP提供的能量，将进入细胞内的药物泵出细胞，使得细胞内药物浓度不断下降，最终使药物细胞毒作用减弱甚至丧失出现耐药［2］。中药下调P—gp蛋白的实验研究较多，下面就分体外与体内实验分别阐述。
1.1 体外实验研究解霞等［3］对川芎嗪(TMP)逆转多药耐药机制的研究显示MCF—7/ADM 细胞P—gp蛋白表达率为(90.60±0.41)％，而加入非细胞毒性剂量川芎嗪后，耐药细胞P—gp的表达率则降为(69.10±1.65)％（P0.01），结果提示TMP能显著抑制MCF—7/ADM细胞 P—gp的表达。谢长生等［4］复方三根制剂对MDR细胞株K562/ADR和K562/VCR逆转作用的研究，结果复方三根制剂对K562/ADR 作用24，48，72 h后 P—gp蛋白表达量分别降为622±6.56，730±4.51，310±1.09，而对K562/VCR作用24，48，72h后P—gp表达量分别降为1054±83.16，775±7.02，3393±6.56，与空白对照组相比，能显著下调P—gp蛋白的表达，且有显著性差异（P0.05），提示其逆转多药耐药的作用可能与其下调P—gp蛋白的表达有关。许文林等［5］对汉防己甲素逆转多药耐药机制的研究发现 P—gp蛋白在K562/ADM细胞中呈现高表达，经10μmol/L的汉防己甲素处理细胞48h后，细胞平均荧光强度减弱，P—gp蛋白的表达减少，另外经汉防己甲素作用后，K562/ADM细胞中的MDR1基因拷贝数明显下降(P0.01)。
1.2 体内实验研究李贵海等［6］粉防己碱对获得性多药耐药小鼠S180肿瘤细胞相关蛋白的调控研究显示单纯应用DDP的模型组，其P—gp蛋白的表达为13.13±5.33，而粉防己碱无毒性高低剂量组其表达分别降为7.41±3.35和9.22±2.36，且其抑制率显著提高,揭示逆转耐药的机制可能与其降低P—gp蛋白的表达有关。 另据实验报道，中药三氧化二砷、ECCG、甲基莲心碱、补骨脂素等也可下调P—gp蛋白的表达而达到逆转多药耐药的作用［7～10］。
2 多药耐药的非经典途径 由MDR1基因编码的P—gp蛋白过度表达介导的药物外排是产生MDR的经典机制，除此外，MDR还与多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白（LRP）、谷胱甘肽Ｓ转移酶、拓扑异构酶、细胞凋亡等多种非经典机制密切相关。
2.1 MRP介导的多药耐药多药耐药蛋白1(MRP1)属于ATP结合的盒式(ATP—binding cassette，ABC)运输蛋白家族成员，它可以通过细胞膜转运多种抗肿瘤药，从而限制抗肿瘤药进入细胞［11］。 徐萌等［12］用汉防己甲素逆转肺癌耐药实验研究发现经汉防己甲素处理12，24，36 h后MRP蛋白表达量的表达分别为32.21±4.79，30.56±4.58，25.55±7.58，而对照组则分别为53.42±7.42，52.98±10.35，60.98±9.37，差异有非常显著性意义(P0.01)，提示汉防己甲素可以下调肺癌耐药细胞MRP蛋白表达。成静等［13］对三氧化二砷研究显示MRPmRNA在耐药细胞A549/R中均呈过表达状态，A549/R细胞经浓度为0.150，0.375，0.750 μmol/L 的As2O3作用48h后，MRPmRNA的表达水平呈不同程度的降低，且随着其浓度增加，MRPmRNA表达水平逐渐下降。 另外，王利等［14］葛根素逆转人胃癌裸鼠原位移植瘤多药耐药性的体内实验研究显示5—FU联合葛根素组MRP蛋白阳性表达率为37.5%，显著低于对照组生理盐水组（82.5%）及单纯5—FU组（74%）（P0.05），提示其逆转多药耐药作用与其下调MRP蛋白阳性表达率有关。
2.2 谷胱甘肽介导的多药耐药多药耐药的产生机制复杂多样，其中谷胱甘肽S—转移酶活性的增强是产生多药耐药的重要机制。肖希斌等［15］的研究显示K562/A02细胞GST—π的PCR扩增带亮度较强，而经甲基莲心碱(Nef)处理组PCR扩增带亮度明显减弱，提示Nef在mRNA水平上抑制GST—π基因的mRNA转录，蛋白质印迹检测结果亦显示，未经药物处理的K562/A02组的蛋白杂交带，明显强于K562/A02+Nef组，表明Nef能抑制GST—π蛋白的表达。 苗立云等［16］青蒿琥酯逆转K562/A02细胞耐药性机理的研究显示K562/A02细胞内GSH呈现高表达(P0.05)，经100μg/ml 青蒿琥酯处理48 h后，K562/A02细胞内GSH含量较药物处理前明显降低(P0.05)。
2.3 核转录因子介导的多药耐药核转录因子（NF—κB）在细胞增殖和凋亡中起关键调控作用，而目前有研究显示其在多药耐药的产生中也扮演着重要的角色，陈进伟等［17］K562/A02耐药细胞NF—κB活性测定的研究发现活化后K562/A02细胞NF—κB表达明显增强(P 0.01)，提示K562/A02细胞耐药可能与增高的NF—κB活性相关，其研究显示经无毒性剂量葛根素处理后的K562/A02细胞的NF—κB活性较未经葛根素处理前明显降低(P0.01)。宋玉成等［18］对盐酸千金藤素（CH）逆转EAC/ADR细胞多药耐药性的机制研究发现耐药细胞中活性高于敏感细胞 (P0.05)，化疗药ADR可激活耐药细胞的NF—κB活性，对敏感细胞无影响，其研究显示CH不但可抑制EAC/ADR细胞中NF—κB持续性活性，而且可抑制ADR对NF—κB的激活，体内实验显示荷瘤小鼠EAC/ADR细胞核内NF—κB呈持续性活化状态，ADR作用2h后诱导NF—κB活化，CH与ADR合用2h后，可明显抑制ADR对NF—κB活性的诱导。
2.4 LRP及拓扑异构酶介导的多药耐药肺耐药相关蛋白（LRP）与拓扑异构酶亦是近期研究较多的耐药介导介质。LRP作用机制是通过降低药物的核质分布比率和通过囊泡、胞吐作用将药物排出细胞［19］。拓扑异构酶(TopoⅡ)是调控DNA拓扑状态的酶类，据研究发现，TopoⅡ质和量的改变会直接影响与DNA的结合，导致药物诱导产生的裂解复合物形成减少，从而导致耐药。孙付军等［20］研究发现苦参碱可以逆转小鼠S180肿瘤细胞获得性多药耐药，其研究表明经其诱导后LRP、TOPOⅡ小鼠瘤体中可呈稳定高表达，而给予小鼠100mg/kg苦参碱后的瘤体中两种蛋白的表达率分别降低为（10.76±6.28）%和（8.58±4.1）%，与对照组相比呈现显著性（P0.01），其逆转作用可能与其调控LRP及TopoⅡ的表达有关。季旭明等［21］对温下方逆转A549/DDP细胞的多药耐药的研究发现A549/DDP细胞MRP呈现高表达，A549/DDP细胞经温下方含药血清组处理24 h后，含药血清组+DDP能明显降低LRP表达，且与对照组比较有显著性差异(P0.05)。盖晓东等［22］柴胡逆转肝细胞癌多药耐药的研究表明，经柴胡作用后，TopoⅡmRNA升高，揭示其逆转多药耐药作用可能与调控TopoⅡmRNA基因表达有关。
2.5 降低细胞内CA2+浓度Ca2+是细胞内一个重要的调节细胞生长、分泌和传导等机制的信使，自从Tsuruo等初次发现MDR表型的肿瘤细胞内游离Ca2+浓度增高以来，许多实验证明耐药肿瘤细胞中Ca2+浓度高于非耐药肿瘤细胞，又有学者证实钙拮抗剂可逆转细胞对药物的耐药性。蔡宇等［23］补骨脂素对HL60/HT耐药细胞逆转及对细胞内Ca2+浓度影响研究发现耐药株HL60/HT细胞内Ca2+浓度明显高于敏感株HL60(P0.01),而加用补骨脂素1—20 μmol/L,尤其补骨脂素10和20 μmol/L 两个剂量，Ca2+浓度与作用时间呈现负相关性，该动态结果说明了补骨脂素具有影响耐药细胞HL60/HT内Ca2+浓度趋势。王金华等［24］用粉防己碱逆转人乳腺癌MCF—7多药耐药细胞的作用显示粉防己碱（Tet）与VCR合用处理耐药细胞，可明显地增加细胞内游离钙的含量，用Tet 20 umol/L+VCR 5 umol/L处理MCF—7耐药细胞12 h，可使细胞内的游离钙比对照组增加2.6倍。
2.6 凋亡相关基因介导的多药耐药Bcl—2家族是细胞凋亡的关键调控物，其中Bcl—2相对分子量为26 000,蛋白水平与肿瘤细胞的MDR相一致，其过表达的肿瘤细胞凋亡受抑制，同时对阿霉素、长春新碱、顺铂等多种化疗药物耐药，其机制可能在于其产物可以稳定细胞生存，抑制多种因素，包括化疗药物诱导的细胞凋亡，从而使细胞产生耐药［25，26］。 艾小红等［27］甲基莲心碱逆转肝癌HepG2/thermotolerance细胞对阿霉素耐受性的作用发现HepG2/thermotolerance细胞较HepG2细胞高表达Bcl—2蛋白，而甲基莲心碱能够下调HepG2/thermotolerance细胞的Bcl—2表达。钟陆行等［28］参芪扶正注射液对K562/ADM多药耐药的影响研究显示K562/ADM 细胞Bcl—2基因呈现高表达，经10 μl/ml参芪处理后其表达为68.39±3.89,而正常对照组则高达(93.82±2.32)，由此可见参芪扶正注射液可以明显下调Bcl—2表达率。
3 多靶点作用逆转机制 整体观念是中医的基本特点之一。从现代研究的角度看，可以体现在中药治疗肿瘤的多靶点作用。在逆转多药耐药中，中药的作用机制也并非只局限于某一点，而是一个综合的作用,这也正是中药在逆转多药耐药研究中越来越受到人们重视的原因之一。
3.1 体外实验研究侯华新等［29］用板蓝根高级不饱和脂肪酸对耐药肝癌细胞株BEL—7404/ADM逆转作用实验发现P—gp、MRP蛋白在Bel—7404/ADM 细胞中呈现高表达（与Bel—7404相比，P0.01），经ADM及无细胞毒性浓度的板蓝根联合作用的Bel—7404/ADM 细胞内ADM含量较单独ADM作用时明显增加(P0.01),提示其作用机制可能与其同时降低P—gp、MRP蛋白的表达有关。王利等［30］榄香烯对耐药胃癌细胞的逆转实验研究发现SGC7901/VCR细胞膜和胞浆内均有P—gp和MRP表达，为强阳性染色”+++“，加入榄香烯后SGC7901/VCR细胞也存在P—gP和MRP的表达，但为”+“至“++”。盖晓东等［31］柴胡逆转肝细胞癌多药耐药作用与相关机制的研究，结果表明柴胡逆转Be17402细胞多药耐药显示经柴胡作用后，可明显的抑制Be17402细胞MDR1/mRNA和P—gp的表达，升高TopoⅡmRNA水平，揭示其逆转多药耐药作用可能与调控多种耐药基因有关。
3.2 体内实验研究董琳等［32］甲基莲心碱对胃癌多药耐药的逆转作用研究发现P—gp、MRP在 SGC7901/VCR细胞中呈现高表达（P0.05），经10 μmol/L Nef处理24 h后，其阳性表达率分别下降至19.97％，10.37％。孙付军等［33］粉防己碱逆转获得性多药耐药小鼠S180肿瘤细胞P170过度表达与调控细胞凋亡相关性研究动物实验表明，粉防己组高、低剂量组P—gp的表达率分别为（7.35±3.65）%，（13.26±4.27）%，显著低于对照组（28.12±9.79）%，另外还促进细胞凋亡相关因子Fas和Trail的表达，从而促进细胞凋亡，并且明显降低耐药S180细胞的黏附因子CD54的表达，由此可知其主要通过降低MDR细胞膜P170过度表达和促进细胞凋亡因子的表达两方面的作用来逆转多药耐药的。