邻氨基酚去甲表鬼臼毒素抗骨肉瘤SOSP9607细胞作用及机理研究

【摘要】目的: 研究 邻氨基酚去甲表鬼臼毒素（ODE）抗骨肉瘤SOSP9607细胞作用及机理. 方法 :采用MTT比色法测定体外抗骨肉瘤SOSP9607细胞作用，透射 电子 显微镜观察细胞凋亡形态学；采用激光共聚焦显微镜测定SOSP9607细胞内［Ca2+］,［Mg2+］,pH值和线粒体膜电位（MMP）的荧光强度；免疫细胞化学技术检测细胞内Bc12和Bax表达.结果:ODE时间、浓度依赖性地抑制SOSP9607细胞生长，诱导细胞凋亡具有典型的凋亡形态特征如细胞膜表面微绒毛消失、核固缩、核碎裂等；剂量依赖性地增加SOSP9607细胞内Ca2+，Mg2+浓度而降低细胞内pH值和线粒体膜电位；使SOSP9607细胞内Bcl2蛋白表达下降而Bax蛋白表达增加.结论:邻氨基酚去甲表鬼臼毒素在体外实验中能明显抑制骨肉瘤SOSP9607细胞生长，其作用机制可能与改变细胞内环境稳态及Bcl2和Bax蛋白表达而诱导细胞凋亡有关. 【关键词】邻氨基酚去甲表鬼臼毒素骨肉瘤肿瘤细胞凋亡线粒体膜电位bcl2蛋白Bax蛋白 　　0引言 　　骨肉瘤是起源于骨组织的最常见的恶性肿瘤，又称成骨肉瘤，任何年龄均可发病，而以15～25岁青少年居多.是原发性恶性骨肿瘤中最常见，恶性程度最高的骨肿瘤，有早期发生远处转移(易发生肺转移)的特点，预后不良.通常认为，骨肉瘤只要明确诊断，尚无肺转移，应施行高位截肢术或关节离断术，若合并单一肺转移源者可同时施行截肢术和肺转移源切除术.但是，骨肉瘤恶性程度高，截肢等破坏性手术后，生存机会从未超过20%，且骨肉瘤截肢术后80%以上患者均会出现肺转移［1—3］，基于这样的事实， 目前 骨肉瘤之 治疗 强调早期综合治疗.在早期综合治疗的措施中，由于骨肉瘤对放射治疗不敏感，仅用于手术前、后之辅助治疗，或肿瘤不能切除或肺转移时 应用 .所以骨肉瘤早期综合治疗措施以手术和化疗为主.这就促使了众多的学者寻找有效的抗骨肉瘤药物，试图通过化疗以期改善骨肉瘤患者的预后. 论文代写 　　鬼臼是一传统的抗肿瘤中草药，其衍生物VP16，VM26已成功用于临床，对多种肿瘤显示出良好的效果［4—5］，被认为是最有效、最有希望的抗骨肉瘤药物.但由于其溶解度差，生产工艺复杂，毒性高等原因限制了其广泛应用.新近发现鬼臼毒类衍生物有很强的抗氧化、清除自由基作用，此作用与其抗肿瘤作用相关［6—7］.因此，鬼臼成为最有希望研发高效低毒抗骨肉瘤新药的领域.据此我们将研究新鬼臼毒类衍生物邻氨基酚去甲表鬼臼毒素抗骨肉瘤作用，并初步探讨其机理. 　　1材料和方法 　　1.1材料邻氨基酚去甲表鬼臼毒素由兰州大学化工学院田瑄教授惠赠，用50g/LDMSO溶解；RPMI1640为GIBCO公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生物有限公司产品，室温溶化后置56℃水浴灭活30min，无菌分装密封后置—20℃冰箱冷冻保存备用；胰蛋白酶（Trypsin,Try）∶Difco1∶250，上海化学试剂站分装厂产品，用无Ca2+，Mg2+的DHanks配成2.5g/L溶液；四甲基偶氮唑盐［3(4,5dimethylthiazol2yl)2,5diphenyltetrazoliumbromide,MTT］为Sigma公司产品，用0.01mol/LPBS（pH为7.2）配成5g/L（临时现配）；十二烷基硫酸钠(Sodiumdodecylsulfate,SDS)为Sigma公司产品，用0.01mol/L盐酸配成100g/L的酸化SDS溶液，室温保存备用；Fluo3/AM,MagFluo4/AM,CarboxySNARF1/AMandMitoTrackerGreenFM探针为MolecularProbesCo.(Eugene,Oregon,USA)产品.鼠抗人Bcl2单克隆抗体（Clone：Bcl2），鼠抗人Bax单克隆抗体（Clone：2D2）为Zymedlabortrory产品，均1∶100稀释.HistostainPlusKit(抗小鼠免疫组化试剂盒，LHK611)为晶美公司产品. 　　1.2方法 　　1.2.1细胞株及培养成骨肉瘤SOSP9607细胞株由第四军医大学唐都 医院 全军骨肿瘤研究所实验室引进.细胞株用含体积分数为100mL/L的小牛血清、2mmol/LL谷氨酰胺（LGln）,1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI1640完全培养液，在37℃，50mL/LCO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养.传代时先用2.5g/L胰蛋白酶（Try）消化2~4min，倾弃Try，再用培养液将细胞吹打制成单细胞悬液传代，每2~3d传代一次，取对数生长期细胞用于实验. 　　1.2.2邻氨基酚去甲表鬼臼毒素对SOSP9607细胞生长的抑制作用取对数生长期SOSP9607细胞并制成2×108细胞/L单细胞悬液，每孔90μL接种于96孔培养板，实验组分别加入不同浓度的ODE（终浓度6.25~200mg/L），对照组加入等量溶媒（终浓度5g/LDMSO），调零孔加不含细胞的完全培养液100μL，每组设四个复孔.在37℃，50mL/LCO2及饱和湿度的培养箱中培养，培养结束前4h每孔加入5g/LMTT10μL，继续培养4h后每孔加入细胞裂解液100g/LSDS100μL终止反应，过夜，振荡摇匀后，全自动酶联免疫检测仪（ELx800型，美国BioTEK产品）测定各孔在570nm波长的A值，读取4孔A值并求其平均值，并 计算 药物对肿瘤细胞的抑制率.细胞抑制率（IR%）=（1—A药物组/A对照组）×100%。

1.2.3透射电子显微镜（Transmissionelectronmicroscopy，TEM）检测SOSP9607细胞凋亡形态学变化将对数生长期SOSP9607细胞以1×108/L的浓度接种于培养瓶，加入不同浓度ODE，对照组加入等量溶媒（终浓度5g/LDMSO），培养24h后，收集细胞，PBS液洗3次，弃上清液，用30g/L戊二醛固定液连续固定2次，每次30min，10g/L锇酸4℃固定2h，然后分别用500,700,90mL/L的丙酮各脱水15min，1000mL/L丙酮脱水45min.浸入1∶1丙酮包埋剂混合液，置室温下1h.浸入包埋剂37℃过夜.60℃固化48h，降温后保存于干燥器内.钻石刀将选定区域修成电镜切片团块，超薄切片机切片后贴于铜网上进行观察. 　　1.2.4激光共聚焦显微镜测定SOSP9607细胞内［Ca2+］,［Mg2+］,pH值和线粒体膜电位（MMP）的荧光强度SOSP9607细胞以2×108/L的浓度接种于培养瓶，加入不同浓度ODE，对照组加入等量溶媒，每组3瓶，培养24h后，用2.5g/L胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，PBS液洗涤3次，每瓶细胞分为4份，根据分子探针说明书在37℃避光条件下分别应用Fluo3/AM(5μmol/L),Magfluo4(5mmol/L),CarboxySNARF1/AM(10μmol/L)和MitoTrackerGreenFM(1.25μmol/L)负载细胞，孵育45min后用PBS液洗涤2~3次，制备细胞悬液滴片，用激光共聚焦显微镜测定细胞内［Ca2+］,［Mg2+］，［H+］和MMP荧光强度. 毕业论文 　　1.2.5免疫细胞化学方法（Immunohistochemistry,IHC）观测SOSP9607细胞内Bcl2,Bax蛋白表达变化将对数生长期SOSP9607细胞以1×108/L的浓度接种于培养瓶，加入不同浓度ODE，对照组加入等量溶媒（终浓度5g/LDMSO），培养24h后，收集细胞，预冷PBS液洗3次，涂片，立即风干，冷丙酮饱和湿度固定，PBS漂洗，加30mL/LH2O2甲醇液以消除内源性过氧化氢酶的作用，PBS漂洗，加试剂A(山羊血清),室温饱和湿度孵育10min，弃去山羊血清，加100μL适量一抗，4℃饱和湿度过夜孵育，PBS漂洗，加试剂B(抗小鼠生物素化二抗)，室温饱和湿度孵育10min，PBS漂洗，加试剂C（HRP标记链亲和素），室温饱和湿度孵育10min，PBS漂洗，加DAB显色液室温显色（时间以镜下观察为准），自来水充分冲洗，苏木素复染，盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，镜检（阳性部位应显棕黄或棕褐色）. 　　统计学处理：实验结果用x±s表示.组间比较用方差 分析 及Dunnettt检验,P0.05为有统计学意义. 　　2结果 　　2.1邻氨基酚去甲表鬼臼毒素对SOSP9607细胞生长的抑制作用MTT比色法检测结果（表1）显示邻氨基酚去甲表鬼臼毒素对SOSP9607细胞生长有明显的抑制作用，邻氨基酚去甲表鬼臼毒素作用24h抑制SOSP9607细胞生长的最低有效量为25mg/L，抑制率为14.8%，抑制作用随浓度的增加而增加，200mg/L的抑制率为45.0%；作用48h时抑制作用进一步增强，最低有效量为6.25mg/L，6.25~200mg/LODE对SOSP9607细胞生长的抑制率依次为15.4%，25.9%，36.4%，49.9%，61.9%和74.7%，IC50为50.0mg/L，说明ODE能时间、浓度依赖性地抑制SOSP9607细胞生长.

表1ODE抗骨肉瘤SOSP9607细胞作用（略） 　　aP0.05,bP0.01vs对照. 　　2.2邻氨基酚去甲表鬼臼毒素对SOSP9607细胞凋亡形态学的 影响 与对照组比较，实验组SOSP9607细胞出现明显的凋亡形态学变化：细胞膜表面微绒毛消失、核固缩、核碎裂及空泡等（图1）. 　　2.3邻氨基酚去甲表鬼臼毒素对SOSP9607细胞内［Ca2+］，［Mg2+］，pH值和线粒体膜电位的影响ODE剂量依赖性的增加SOSP9607细胞内Ca2+浓度，200mg/L时较空白对照增加3.16倍.同时，ODE也剂量依赖性的增加SOSP9607细胞内Mg2+浓度(表2). 　　ODE能剂量依赖性的降低SOSP9607细胞内pH值，以100mg/L作用最为明显，抑制率为64.1%；同样，ODE也剂量依赖性的降低SOSP9607细胞线粒体膜电位，200mg/L的作用最为明显，抑制率为40.2%. 　　A:对照;B:ODE50mg/L. 　　图1ODE对骨肉瘤SOSP9607细胞凋亡特征的影响×6000（略） 　　表2ODE对骨肉瘤SOSP9607细胞内Ca2+,Mg2+浓度,pH值和MMP的影响（略） 　　aP0.05,bP0.01vs对照. 　　2.4邻氨基酚去甲表鬼臼毒素对SOSP9607细胞内Bcl2，Bax蛋白表达的影响与对照组比较，ODE浓度为50mg/L时,Bax蛋白表达增多,而Bcl2蛋白表达下降（图2）.

3讨论 　　鬼臼毒素类药物如VP16等是典型的细胞凋亡诱导剂，我们也发现邻氨基酚去甲表鬼臼毒素能诱导骨肉瘤OS9901细胞凋亡.一般认为，细胞内离子稳态的紊乱是细胞凋亡或死亡的最主要原因，也是大多数化疗药物作用的结果.Ca2+是细胞内一个重要的调节细胞生长、分泌和信号转导等机制的第二信使之一［8］.目前，Mg2+对细胞凋亡的影响尤其引人注目，因为细胞内Mg2+是真核细胞最富有的二价金属离子，假若没有细胞内Mg2+，Ca2+共存，Ca2+行使第二信使的功能则是不完整的，Ca2+要引起反应必需Mg2+［9］.本研究中，邻氨基酚去甲表鬼臼毒素使SOSP9607细胞内的Ca2+和Mg2+浓度明显增加，这表明Mg2+可能辅助Ca2+共同增强核酸内切酶的活性而诱导细胞凋亡.