复方脑得生中黄酮类成分的高效液相色谱指纹图谱研究
作者：王光忠 李桥 宋恬 张明 樊文娟 刘焱文。
【摘要】 目的采用高效液相色谱（HPLC）法测定复方脑得生总黄酮的指纹图谱。 方法采用D—101树脂分离纯化脑得生黄酮类成分。色谱柱为Hypersil ODS— C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇—乙腈—0.2％磷酸水溶液，梯度洗脱；检测波长210 nm；流速1.0 ml·min—1; 柱温25℃；分析时间100 min。结果指纹图谱中标示了23个共有峰，其峰面积之和大于总峰面积的90%，方法精密度、稳定性、重复性均符合指纹图谱有关规定。利用指纹图谱相似度测试软件，测定11批脑得生总黄酮指纹图谱相似度结果均在0.95～1.00之间。结论实验结果为脑得生制剂的质量控制提供了依据。
【关键词】 复方脑得生 黄酮类成分 指纹图谱 高效液相色谱法。
脑得生丸（片）收载于《中国药典》2005年版Ⅰ部，由三七、川芎、红花、葛根、山楂5味中药组成，具有活血化瘀、通经活络的功效。用于瘀血阻络所致的眩晕、中风，症见肢体不用、言语不利及头晕目眩；脑动脉硬化、缺血性脑中风及脑出血后遗症见上述证候者［1］。临床应用广泛,疗效确切。但其制备方法为传统生产工艺，质量可控性差，药物稳定性难以控制，因而对临床疗效和患者服用有较大的影响，不能适应现代临床用药要求。研究表明，脑得生的主要活性部位为黄酮类成分、三七总皂苷和川芎油［2］，其中葛根、山楂、红花所含黄酮类成分具有多种药理作用［3～5］。为保证制剂质量和临床疗效，前期进行了制剂中药材的活性部位提取纯化的工艺研究。本研究以黄酮为主要分析对象，采用HPLC法对脑得生总黄酮提取物进行了指纹图谱研究，为脑得生制剂的质量控制提供科学依据。
1 仪器与试药。
1100型Agilent高效液相色谱仪;BP211D电子天平（sartorius公司）。葛根素、羟基红花黄色素A对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号分别为110752－200209、111637－200502）；试剂均为分析纯，甲醇（上海振兴化工一厂），乙腈（国药集团化学试剂有限公司），磷酸（武汉化学试剂厂）；水为双蒸水。脑得生总黄酮提取物（自制，批号070621，070630，070712，070719，070726，070703，070710，070717，070724，070731,070823）。
2 方法与结果。
2.1 色谱条件色谱柱Hypersil ODS— C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相见表1；检测波长210 nm；流速1.0 ml·min—1; 柱温25℃ 。表1 流动相梯度变化（略） 2.2 对照品溶液的制备称取葛根素、羟基红花黄色素A对照品适量，加40％的乙醇配成浓度分别为0.081，0.147 mg·ml—1的溶液，即得。
2.3 脑得生总黄酮提取物的制备方法称取葛根、山楂和红花饮片共500 g（按处方组成，葛根∶山楂∶红花为261∶157∶91），70％乙醇回流提取3次。第1次用乙醇5 000 ml，回流提取2 h；第2次用乙醇4000 ml，回流提取1 h；第3次用乙醇3 000 ml，回流提取1 h。合并3次提取液，回收乙醇至无醇味，放置过夜，滤过，溶液稀释至每毫升含生药0.1 g，上D—101树脂柱（1.5 kg树脂），上样流速为2 BV·h—1，上样后先用5BV的蒸馏水冲洗，再用5 BV40％乙醇以3 BV·h—1流速洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩至小体积，干燥，即得。共制得11批。
2.4 供试品溶液的制备取脑得生总黄酮提取物约0.4 g，精密称定，置50 ml量瓶中，加40％的乙醇溶液超声溶解，定容至刻度，摇匀，即得。
2.5 测定方法分别精密吸取供试品溶液10 μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件操作，考察150 min内供试品溶液的色谱分离情况，记录100 min色谱图。结果见图1。
2.6 方法学考察。
2.6.1 精密度与稳定性实验取同一供试品溶液（批号：070710），分别于0，2，4，6，8，10 h进样测定。测定结果表明，其共有峰相对保留时间和峰面积比值的RSD均小于3％，表明仪器的精密度良好，供试品溶液在10 h内基本稳定。
2.6.2 重复性实验精密称取7号样品（批号：070710）6份，按上述供试品溶液的制备方法操作，进行测定，结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的RSD分别为0.06％～0.56％，1.20％～2.90％，符合指纹图谱的要求。
2.7.1 共有指纹峰的标定根据11个批次提取物的检测结果，比较其色谱图。结果见图2。以相对保留时间标定其共有峰共23个，以8号峰为参照峰，测定各共有峰相对保留时间和相对峰面积的比值，其RSD均小于3％。