肝细胞损伤与细胞凋亡及肝细胞保护
提要 细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，多数研究显示，在各种肝疾病中，肝细胞损伤的结果可导致肝细胞凋亡，抑制细胞凋亡可达到保护肝细胞损伤的目的，凋亡抑制剂的运用将为临床上防治各种肝损伤提供新的途径。
细胞凋亡(apoptosis)是细胞死亡形式之一，它以细胞DNA发生特异性的降解，形态上表现为核固缩、胞膜发泡和凋亡小体形成为特征，是由特定的基因调控，无明显细胞溶解的自杀过程。诸多生理及病理过程均有凋亡参与调节。近来大量的研究表明，细胞凋亡在肝细胞损伤过程中发挥重要作用。
1.1.1常见的肝毒性药物 二甲基亚硝胺、放线菌酮、硫代乙酰胺等均为常见的肝毒性药物。体内及体外试验均发现它们可诱导肝细胞发生凋亡（1）。给鼠喂饲四氯化碳可产生经典的急性肝损伤动物模型，既往认为这种肝损伤的结果是坏死，近来Shi等（2）的研究向这一观点发出挑战，经运用流式细胞仪、透射电镜、电泳及原位末端标记等技术均检测到这种肝损伤动物模型的肝脏存在细胞凋亡。扑热息痛（醋氨酚，acetaminophen）过量使用可对机体产生严重的肝损害，甚至死亡，其肝损伤机制近年来研究较多，有报道其与凋亡有关（3）。
1.1.2抗肿瘤药物 现在普遍认为，抗肿瘤药的抗癌机理之一为抗肿瘤药诱导肿瘤细胞发生凋亡。也有文献报道抗肿瘤药也可诱导正常肝细胞凋亡，如Tsuki—date等（4）发现，经秋水仙碱与长春新碱处理后的体外培养的肝细胞，出现细胞凋亡所具有的典型的生化学特征，即梯状DNA电泳图谱。联系到许多抗肿瘤药的肝毒性，不难推测其与细胞凋亡有联系。
1.2.1暴发性病毒性肝炎 有研究间接认为暴发性肝炎的发生与细胞凋亡有关，因为暴发性肝炎患者血液中可溶性Fas配体（sFas l）含量明显高于正常人，并与血液中ALT、AST并行升高，呈明显的正相关（5）。Fas抗体可诱导鼠发生暴发性肝功衰，蛋白水解酶抑制剂可抑制肝细胞凋亡，减轻Fas抗体引起的肝损伤程度（6）。
1.2.2慢性病毒性肝炎 有研究报道，慢性乙肝与丙肝患者肝活检标本中，肝细胞凋亡率明显高于正常人，前者在平均6‰左右，后者在1‰以下，两组在统计学上有显著差异。慢性病毒性肝炎病检中常见嗜酸性小体，局灶性死亡，现在认为均是调亡的典型表现，而且，经IFN—α治疗后，肝脏的凋亡情况明显改善，肝功能发生好转（7）。这些都提示细胞凋亡与慢性病毒性肝炎有关。
1.3细胞凋亡与酒精性肝病 给大鼠长期喂饲酒精，鼠肝细胞凋亡的比例会明显增加。Kawahara等为研究人酒精性肝病的凋亡情况，通过运用对Lewis抗原及断裂的DNA（两者均为凋亡之表现）的检测，发现除脂肪肝外，处于临床各期的酒精性肝病患者活检标本均发现有凋亡的表现，而且有意义的是凋亡多者转氨酶活动增强（8）。
1.4细胞凋亡与胆源性肝损伤 胆道梗阻引起肝细胞分泌及排泄胆汁发生障碍，肝细胞内外胆汁浓度升高。体外实验表现，胆汁中的胆红素与胆汁酸可使培养的鼠肝细胞发生凋亡，表现典型的凋亡时的形态学及生化学变化，且呈浓度依赖与时间依赖效应，浓度越高凋亡越多，作用时间越长，凋亡亦增加（1）。由此可知，肝细胞凋亡亦可能参与了胆源性肝损伤的病理机制。
1.5细胞凋亡与脓毒血症引起的肝损伤 Haendeler等（9）利用猪内毒休克动物模型观察了肝细胞凋亡的情况，假手术组凋亡率有轻度的升高为对照组的166%±14%，但脓毒血症组升高更明显，达到295%±11%，而且在脓毒血症组肝细胞电泳时出现了梯状DNA带。
1.6细胞凋亡与肝缺血再灌注损伤 缺血再灌注可引起肝损伤。Sasaki等（10）在研究肝缺血再灌注损伤的动物实验发现，缺血再灌注损伤可引起鼠肝细胞凋亡，而且凋亡多发生在再灌注后早期。Kuo等（11）观察了35例临床同种异体肝移植术后肝活检标本的凋亡情况，将缺血再灌注损伤的程度分级，随损伤程度的加重，凋亡的细胞数目增多，轻度损伤者凋亡率为0.3%±0.1%，而中度与重度损伤分别达1.7%±0.3%与6 .7%±1.6%，而且凋亡的程度与缺血再灌注损伤的生化学与病理学参数平行，呈正相关（11）。以上研究均提示细胞凋亡与肝缺血再灌注损伤密切相关。
1.7细胞凋亡与肝移植物排异反应 有人对鼠肝移植标本行组织学检查，不仅凋亡信号阳性，而且细胞凋亡比例随排异反应的演进而增加，随排异反应的消退而减少，细胞凋亡反映了排异反应的严重程度（12）。也有研究显示同种异体肝移植鼠动物模型的早期（2～7天），肝酶学指标升高与凋亡指数升高呈平行状态，第2天、3天、4天、7天的凋亡指数分别为0.25%、0.38%、0.47%及1.58%，而GST的含量依次为74ng/ml、86ng/ml、255ng/ml与1710ng/ml，而且包括肝实质细胞在内，胆管细胞也发生凋亡。这些也说明细胞凋亡与肝移植引起的排异反应有关（13）。
在肝细胞受到损伤时，有些被称为死亡因子的细胞因子被激活，如Fas l/Fas抗体，TNFα、TGFβ1、INFγ等，通过与靶细胞上的受体结合，引起凋亡的发生。
2.1 Fas/Apo—1传导途径 Fas/Apo—1抗原也称CD95，是效应细胞表面的一种膜受体，属于神经生长因子一肿瘤坏死因子受体家族。携带突变的Fas基因的转基因大鼠体可抵抗由Fas抗体对肝细胞凋亡的诱导。肝细胞表面存在Fas受体，体内与体外实验均证实Fas抗体或Fas配基可通过与Fas接合诱导肝细胞凋亡，血清转氨酶增加，引起暴发性肝功衰。大量的研究显示Fas介导的细胞凋亡与病毒性肝炎、酒精性肝病、感染性休克、脓毒血症及全身炎性反应综合征引起的肝损害有密切关系（5）。
2.2 TNFα及其受体传导途径 TNFα是具有多种生物学效应的细胞因子，对肝脏的生长、炎性反应及细胞毒性均有调节作用。体内及体外实验均发现，TNFα可诱导肝细胞凋亡，这是因为：（1）TNFα不仅诱导肝细胞死亡，而且能介导Kupffer氏细胞及肝窦内皮细胞发生凋亡；（2）在活体内经予大量的放线菌素D导致肝组织内TNFαmRNA表达增加，凋亡增多，而若经抗TNFα的血清处理后肝细胞损伤受到抑制（16）；（3）直接注射TNFα到活体肝脏内，有凋亡典型的DNA梯带出现（17）。TNFα效应通过2类细胞表面受体介导，即TNFα—R1与TNFα—R2。TNF引发的凋亡活动主要与TNFα—R1有关。这提示TNFα及其受体在肝毒性药物、脓毒血症等引起的肝损伤方面会起着重要的作用。
2.3TGFβ1及其受体途径 TGFβ1是抑制上皮细胞生长的多肽家庭族中的一员，是强有力的人或鼠肝细胞DNA合成抑制剂。有丝分裂原诱导的发生凋亡的肝脏组织内，TGFβ1前体表达明显增加，外源性的TGFβ1可诱导培养的肝细胞发生凋亡，慢性病毒性肝炎及酒精性肝病患者的肝脏TGFβ1持续增加（1），这些均提示TGFβ1在肝损伤引起的细胞凋亡中起作用。以前认为肝脏只有非实质细胞分泌TGFβ1，现在研究发现肝实质细胞与肝外组织均可分泌TGFβ1，这样TGFβ1可通过自分泌、旁分泌、远距分泌等方式对肝细胞引发凋亡活动。TGFβ1是通过TGFβ1受体起作用的，其受体有TGFβ1—R1、TGFβ1—R2与TGFβ1—R3三种，肝细胞均表达这三种受体，在肝细胞受到损伤时，这三种受体的表达发生上调（18）。这些研究也表明TGFβ1及其受体途径在肝细胞凋亡中发挥的重要作用。
2.4INF—γ途径 INF—γ是激活的T细胞及NK细胞分解的一种细胞因子，其生物学作用主要是诱导主要组织相容性抗原（Ⅰ型与Ⅱ型）的表达，刺激TNF的产生，促进机体对病原微生物的清除。在调节机体的宿主反应、炎症及自体免疫方面起重要作用。由cancanaval—in a(Con—A)诱导的急性肝损伤动物的肝组织内凋亡率明显增高的同时，INF—γ也增加，抗INF—γ血清不仅能降低肝损伤的程度，亦能改善肝细胞凋亡的情况（19）。在带有INF—γ缺陷 基因的转基因鼠体内由Con A诱导的肝损伤活动受到抑制，在免疫性肝炎、病毒性肝炎、肝移植排异性反应病人发生肝损伤时，INF—γ明显较正常人增高（20）。这都说明INF—γ与肝损伤、肝细胞凋亡间有密切关系。
2.5颗粒—排粒途径 T细胞被激活后，释放含穿孔素与颗粒酶的颗粒，在Ca2 +的借助下，颗粒在靶细胞膜上穿孔，进而颗粒酶（granzyme)进入靶细胞内，引起靶细胞DNA降解活动。对这种颗粒酶的研究也较多，已从人及鼠体内提取了10余种酶，目前认为起主要作用的是granzyme a 与granzyme B（12）。
无论是受体介导的传导，还是通过颗粒—排粒途径，细胞凋亡时，在引起DNA降解之前几乎都存在一个共同的通路，即靶细胞内的蛋白水解酶（Caspase)的激活，尤其是蛋白水解酶3的激活最为重要（22）。
近年来，随着研究的深入，相继发现及研制了多种凋亡抑制剂，运用凋亡抑制剂可达到保护肝细胞的目的，但对它们研究仍处于体外实验与动物实验水平。
3.1蛋白水解酶抑制剂与肝细胞保护 如前所述，蛋白水解酶激活，是凋亡细胞DNA降解的前提，尤其是蛋白水解酶3的激活可以说是必经之路，那么抑制这些蛋白水解酶的激活也会达到抑制凋亡的目的，有研究亦证实这一假说，如Kunstle等（23）运用蛋白酶抑制剂7—VAD—fluoromethylketone（FMK）可以保护鼠肝脏免受Fas l 或TNF—α诱导急性肝损伤，并呈浓度效应关系。
3.2外源性cAMP与肝细胞保护 外源性的cAMP使肝细胞凋亡发生抑制，同对照组相比，明显改善鼠肝损伤的情况。将CP—cAMP（cAMP之供体）直接作用于培养的鼠肝细胞，可抑制胆酸诱发的肝细胞凋亡活动，保护肝细胞，减轻其损伤程度（24）。
3.3一氧化氮（NO）与肝细胞保护 体内及体外试验表明，NO在肝细胞凋亡中起重要作用，如将携带有含NO的药物，这种药物在肝脏代谢后，释放出NO使肝脏局部达到高浓度NO，结果这种方法能有效地保护肝细胞受TNFα及放射菌素D所诱导的凋亡，而几乎不影响体循环血流动力学（25）。最近，还有学者利用携带有NO合成酶基因的腺病毒处理体外培养的肝细胞，以便使肝细胞内NO合成酶表达增加，以致NO的合成增加，结果发现肝细胞能较好地抵抗TNFα与放线菌素D对其诱导的凋亡活动（26）。
精氨酸是NO的供体，在一个肝缺血再灌注损伤的动物实验中，给猪提供外源性精氨酸（540 mg/kg,iv)后发现，同对照组相比，实验组动物的凋亡指数明显降低，动物存活时间延长，循环血中肝功能指标明显得到改善（27）。
3.4促增殖剂与肝细胞保护 角质细胞生长因子（KGF）属于成纤维生长因子家族中的一员，其有促进上皮细胞增殖的作用。体内与体外实验均证实，KGF可抑制TNFα与D—galactosanine（GalN）诱导的肝细胞凋亡，保护它们诱导的暴发性肝细胞损伤（28）。降脂素（Nafenopin)是一种过氧化酶体类的促增殖剂，给小鼠长期喂饲降脂素可诱发肿瘤，但其对TGFβ诱导的鼠肝细胞凋亡有明显的抑制作用，实验组比对照组之凋亡率减少50%～60%（29）。以上均提示运用促增殖剂可抑制肝细胞凋亡。
3.5其他 近来，其他的肝细胞凋亡抑制剂尚有衣霉素。衣霉素能抑制蛋白发生糖其他反应，体内与体外实验显示，它可抑制TNFα诱导的肝细胞凋亡，降低肝损伤程度（30）。