Bit1基因在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测
作者：滑玮，张伟，吕海鹏，辛晓燕。
Expression of Bit1 gene in a yeast twohybrid system and reporter gene activation assay。
【Abstract】 AIM: To construct a bait vector with Bit1 gene in yeast twohybrid system GAL4, and assay whether Bit1 gene expression product affects the growth of host yeast cells and activates the reporter genes in the yeast twohybrid system. METHODS: The Bit1 gene fragments were amplified by RTPCR from ovarian cell Caov3, and cloned into pUC19 for DNA sequencing. After verified by DNA sequencing, they were subcloned into the bait vector pGBKT7 of yeast twohybrid system GAL4, and the recombinant plasmids were subsequently transferred into yeast cell AH109, and its expression product was tested whether it could activate the reporter genes in the yeast twohybrid system. RESULTS: The Bit1 gene fragments were successfully amplified, and their expression product showed to be nontoxic to AH109 cells, and did not activate the reporter genes of the GAL4 system. CONCLUSION: Yeast twohybrid GAL4 system can be utilized to study Bit1interacting protein.
【Keywords】 apoptosis; Bit1; yeast twohybrid system; reporter genes。
【摘要】 目的：用Bit1基因片段构建酵母双杂交诱饵载体，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法：运用RTPCR技术从卵巢癌细胞系Caov3中扩增出Bit1基因片段，克隆入pUC19质粒，经测序正确后，再克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中，将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果: 成功获得Bit1基因片段，Bit1基因表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性，对报告基因亦无激活作用. 结论：可以利用酵母双杂交Gal4系统来研究与Bit1相互作用的蛋白.
【中图号】 R737。
0引言。
酵母双杂交系统是一种直接在真核细胞内检测蛋白相互作用的方法，具有灵敏度高和特异性好的优点.自***年由Fields等［1］提出并初步建立以来，得到了不断的完善和改进，在细胞生物学，肿瘤学，蛋白质组学等诸多领域有着广泛的应用［2—3］. Jan等［4］在研究bcl2转录调控的实验中，发现了一种可下调bcl2表达的新基因，并因其功能而命名为Bit1（bcl2 inhibitor of transcription 1）.研究表明，胞浆内Bit1浓度的升高可以明显促进凋亡的发生，而其浓度的降低可以减少凋亡的发生.我们拟利用酵母双杂交GAL4系统，构建Bit1蛋白即诱饵蛋白，以期从人脑cDNA文库中钓取可与之结合的蛋白基因，为研究细胞凋亡的发生和调节提供新的思路和实验依据.
1材料和方法。
1.1材料卵巢癌细胞系Caov3购自中国医科大学细胞生物研究所，表达载体pGBKT7及酵母菌种AH109购自Clontech公司.质粒pUC19由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室张伟博士惠赠. 逆转录酶购自Promega公司；PCR试剂盒，DNA重组所用的限制性内切酶购自Takara公司；T4 DNA连接酶购自Gibco公司；质粒提取试剂盒，DNA电泳胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司；酵母培养基购自Clontech公司.
1.2方法。
1.2.1RTPCR扩增Bit1基因自行设计出克隆Bit1基因的引物.常规培养Caov3细胞，提取细胞总RNA, 加入下游引物和逆转录酶，45℃各作用30 min进行逆转录,反应条件为：70℃ 10 min, 42℃ 45 min, 95℃ 5 min. 再取逆转录产物加入引物P1和P2扩增Bit1基因.PCR反应条件为：94℃ 30 s, 61℃ 45 s，72℃ 50 s，共进行38个循环.
1.2.2RTPCR产物克隆及鉴定纯化的RTPCR产物经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，定向克隆入pUC19质粒，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选.酶切鉴定出含插入片段的阳性克隆，命名为pUC19－Bit1，然后进行序列分析.
1.2.3构建及鉴定诱饵载体用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切pUC19－Bit1和表达载体pGBKT7，回收Bit1基因及pGBKT7载体片段，载体片段与Bit1基因连接后转化大肠杆菌DH5α.经限制性内切酶分析,含正确插入片段的克隆命名为pGBKT7－Bit1.
1.2.4制备酵母感受态细胞随机挑取几个酵母菌AH109克隆，接种于50 mL YPDA液体培养基中，振荡培养至A600=0.4～0.5.在室温下将培养液离心，弃上清，重悬沉淀，洗涤酵母细胞.再离心取沉淀，用1.5 mL 1×TE/LiAc溶液重悬，即为酵母感受态细胞.
1.2.5转化酵母感受态细胞将构建好的诱饵载体，鲱鱼精DNA和酵母感受态细胞，混匀后加入0.6 mL PEG/LiAc溶液.在30℃振荡培养, 加入DMSO后混匀, 在42℃水浴15 min, 冰浴2 min,离心, 去上清，以0.5 mL 1×TE重悬细胞后，铺于SD/Trp平板.于30℃培养36 h左右，直至带有诱饵载体的酵母克隆长出.
1.2.6HIS3和LacZ报告基因表达的检测用无菌牙签随机挑取酵母菌单个克隆，分别划线于有Trp，Ura，His，Leu营养缺陷的SD平板上，于30℃培养36 h，观察酵母菌的生长情况. 采用β半乳糖苷酶印膜法检测lacZ报告基因的表达.用无菌牙签随机挑取酵母单个克隆，点样于硝酸纤维素滤膜上.将带有酵母克隆的滤膜在液氮中迅速冷冻5 s后，置于室温裂菌.将点有菌体的滤膜面朝上，放在另一张同样大小浸有Z buffer/Xgal的Whatman#1滤纸上，去气泡，于30℃孵育30 min~8 h，观察颜色变化.