芽孢杆菌外毒素保护性抗原与上游强启动子穿梭载体的构建
关键词：炭疽芽孢杆菌;穿梭载体;重组;基因 摘要:目的构建携带炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）的两种穿梭载体与上游强启动子。
方法将解淀粉芽孢杆菌的α—淀粉酶启动子克隆到载体pbluescript—sk（+）上，构建载体pBLKSP;以A16R疫苗株（Tox+，Cap—，弱毒株）DNA为模板，设计合成内外侧引物巢式PCR扩增获得保护性抗原（PA）的全基因，先克隆到载体pBLKSP，再将其和质粒PUB110重组构建成两种穿梭载体。
结果酶切鉴定显示所切下的片段大小均与预计相符。
测序结果与文献报道序列及预计结果一致。
为在无毒炭疽疫苗株中的高效表达和炭疽芽孢杆菌的分子疫苗研究奠定了基础。
关键词:炭疽芽孢杆菌;穿梭载体;重组;基因 Constructionofshuttlevectorofanthraxtoxinprotectiveantigenwithupstreamstrongpromoter. Abstract:ObjectiveToconstructtwoshuttlevectorofanthraxtoxinprotectiveantigenwithupstreamstrongpromoter.Meth—odsThepromoterregionoftheα—amylasegeneofBacillusamyloliquefacienswasclonedintopbluescript—sk（+）vector;thean—thraxtoxinprotectiveantigenwholegenewasamplifiedbynestedPCRfromA16vaccinestraintemplate.FirstlyitwasclonedintopBLKSPvector，thenrecombinatedwithPUB110vectortoformtwokindsofshuttlevectors.ResultsRestrictionanalysisandDNAsequencingconfirmedthattheclonedgenefragmentsencodedanthraxtoxinprotectiveantigen.ConclusionTwokindsofshuttlevectorshavebeensuccessfullyconstructed.ithassetfoundationforfurtherstudyonthehighlyeffectiveexpressioninnontoxican—thracisstrainandmoleculevaccineresearchofBacillusanthracis. Keywords:Bacillusanthracis;Shuttlevector;Recombination;Gene 炭疽是由炭疽芽孢杆菌（Bacillusanthracis）引起的一种兽源性人畜共患的急性传染病，主要通过皮肤接触、呼吸道、消化道等多种方式感染，其死亡率极高。
炭疽芽孢杆菌含有两种能够独立复制的质粒pXO2和pXO1，分别编码细菌荚膜和炭疽毒素［1］。
质粒pXO1编码3种毒素:保护性抗原（Protectiveanti—gen，PA）、致死因子（Lethalfactor，LF）和水肿因子（Edemafac—tor，EF）［2，3］。
保护性抗原PA介导EF/LF进入细胞内发挥毒性作用但本身并不具有任何毒性，是一种很有效的保护性抗原和免疫原，而且是获FDA批准的人用炭疽疫苗AVA的主要免疫活性成分。
本实验克隆和表达炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）全长基因，以能在芽孢杆菌中自主复制并有穿梭功能的载体PUB110为基础，构建了具有强启动子双筛选功能的两种大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭载体pJB1和pJB2，为进一步其在无毒炭疽疫苗株中的高效表达和能否作为预防炭疽芽孢杆菌感染的分子疫苗打下了基础。
1材料和方法 1.1材料 1.1.1菌株与质粒A16R疫苗株（Tox+，Cap—，弱毒株），无毒炭疽疫苗株（pXO1—pXO2—型ΔSterne—1株）由卫生部兰州生物制品研究所惠赠;质粒Pbluescript—sk（+）由上海生工惠赠;穿梭质粒PUB110邮购自美国ATCC细胞库;GM2163（Dam—Dcm—）由NEB北京总代理公司赠送;HB101感受态细胞购于北京经科宏达有限公司。
1.1.2酶及主要试剂TakaRaLATag酶，TakaRaT4DNA连接酶，购自北京六合通生物技术有限公司;TOPOTMTACloningKits购于invitrogen公司;脑心浸液购于北京经科宏达有限公司KpnI、XhoI、SmaI、BamHI和PstI购于NEB公司。
1.2方法 1.2.1PA抗原上游强启动子的构建根据文献［4］得到解淀粉芽胞杆菌的α—淀粉酶启动子序列:tttgagaaaagaagaagaccataaaaataccttgtctgtcatcagacagggtattttttatgctgtccagactgtccgctgtgtaaaaataaggaataaaggggggttgttattattttactgatatgtaaaatat—35—10aatttgtataa 由上海生工进行全基因合成并将合成好的序列按照相应顺序克隆在质粒pbluescript—sk（+）的SmaI和PstI两个多克隆位点上，经测序序列完全正确，将构建的重组质粒重命名为pBLKSP。
1.2.2巢式PCR扩增PA基因在GENEBANK中找到炭疽毒素质粒pXO1和PA抗原基因的全序列（GI:47566322和GI:10088950），分析PA基因（包括RBS区和信号肽区）在pXO1质粒中对应的位置，然后应用软件PrimerPremier5进行内外侧引物的设计，选择最优化的组合。
外侧引物:sense5’CGTTGGTTAGCTTGGACAGTTGTATG3’ Anti—sense5’TTTAAACGCATAGGATGTGCCATTG3’内侧引物:sense5’GGCTCGAGAAAGGAGAACGTATATGAAAAAACGAAAAGTG3’Anti—sense5’CCGGTACCTTACCTTATCCTATCTCATAGCCTTTTTTAG3’ 1.2.3穿梭载体的构建用KpnI和XhoI双酶切扩增的PA基因及构建成功的含α—淀粉酶启动子的重组质粒pBLKSP，纯化双酶切的产物，并将纯化后的PA基因及重组质粒pBLKSP按摩尔比1:1加入连接反应体系，T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞HB101，涂板于含氨苄青霉素的LB平板上（含X—gal和IPTG），37℃孵育过夜。
挑取白色菌落，提取质粒进行PCR鉴定，筛选阳性克隆，将构建的重组质粒重命名为pBLKSPPA。
用BamHI单酶切质粒PUB110和构建的重组质粒pBLKSPPA，纯化单酶切产物加入磷酸酶去磷酸化（防止自连），将去磷酸化的PUB110和重组质粒pBLKSPPA在65℃水域灭活后按照摩尔比2:1进行连接反应，转化大肠杆菌感受态细胞HB101，涂板于含氨苄青霉素和卡那霉素双抗性的LB平板上，37℃孵育过夜。
挑取白色菌落，提取质粒进行PCR鉴定，筛选阳性克隆，将构建的两种穿梭质粒重命名为pJB1和pJB2（图1）。
图1穿梭质粒pJB1和pJB2的构建（略） Fig1ConstructionoftheShuttleVectorpJB1andpJB2 1.2.4无毒炭疽疫苗株的电转化电转化无毒炭疽疫苗株（PXO1—PXO2—型Δsterne—1株），所用基因脉冲转化仪为Bio—Rad公司产品。
先将重组质粒在GM2163中去甲基化［5］，挑取一环无毒炭疽疫苗株接种于5mlBYGY培养液（1.9%脑心浸液，0.5%酵母提取物，0.2%葡萄糖，0.4%甘油，0.1MTris［pH8.0］）中，37℃摇床225rpm振荡培养12h后取1ml转至新鲜BYGY培养液，至OD600在0.85～0.95左右，4℃，5000×g，离心5min后收集其菌体，悬浮于10%的1ml甘油中，加入10μg在质粒DNA混匀后，冰浴3～7h，取0.4ml混合液置于口径为0.2cm的电穿孔杯内，电转化条件为6.25kv/cm，25μF，1000Ω脉冲作用后，在混合液中加入4ml培养基，37℃振荡培养3h，再涂在含抗生素的选择培养基平皿上，37℃倒置培养直至转化子长出。
2结果 2.1炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因的PCR扩增PCR产物电泳结果证实为单一的DNA条带，分子量大小约2500bp，与预期的2369bp结果一致（图2）。
图2炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因扩增后的琼脂糖凝胶电泳（略） Fig2PCRaplificationproductsofAnthraxToxinProtectiveAntigengene 1:DNAMarkerDL15000;2:PAgene;3:Neganive 2.2重组质粒双酶切鉴定根据重组质粒的序列对其用不同的限制性内切酶切割以鉴定重组片段的大小。
图3穿梭质粒pJB1/pJB2双酶切鉴定及PCR验证（略） Fig3IdentificationofthepJB1/pJB2bydigestionwithrestrictionenzymeandPCRaplification 1:DNAMarkerDL15000;2:pJB1/pJB2digestedbyKpnI;3:pJB1/pJB2digestedbySmaIandKpnI;4:PCRaplificationusingshuttleplasmidpJB1/pJB2 2.3pJB1/pJB2穿梭功能验证PUB110是一个金黄色葡萄球菌/芽孢杆菌穿梭质粒，要检测融合后的新质粒是否仍具有穿梭功能，需将pJB1/pJB2质粒转化到无毒炭疽疫苗株（pXO1—pXO2—型ΔSterne—1株）中加以验证。
电转化后，将平皿中长出的转化子接种在含有10×10—6g/ml卡那霉素的培养基中，37℃下静置培养，经5000r/min离心收集菌体，提取无毒炭疽疫苗株总DNA。
电泳检查可见，无毒炭疽疫苗株基因组DNA以及pJB1和pJB2质粒DNA带（图4）。
图4从无毒炭疽疫苗株和大肠杆菌中提取的穿梭质粒pJB1/pJB2质粒电泳图谱（略） Fig4ShuttleplasmidpJB1/pJB2extractedfromnontoxicAnthraxvaccinestrainandE.coli 1:ChromosomeofnontoxicAnthraxvaccinestrain;2:pJB1/pJB2ex—tractedfromnontoxicAnthraxvaccinestrain;3:pJB1/pJB2extractedfromE.coli;4:λHindIIIdigestDNAMarker。