钛铌锆β钛合金低弹性模量内固定材料的生物相容性研究
【摘要】 目的]通过体内实验的方法对新型β型钛合金(TiNbZr)骨折内固定材料的生物相容性进行评价。[方法](1)改良的鼠气囊模型(the air pouch model):健康成年SD大鼠24只,皮下充气造模后将钛铌铣β型钛合金(TiNbZr)颗粒混悬液注入气囊,收集囊内液体采用ELISA方法测定IL6和TNFα,用囊壁组织学切片进行炎症细胞反应分级和囊壁厚度测量,并与传统的钛铅钒合金(Ti6Al4V)进行比较。(2)接骨板植入模型:将TiNbZr做成接骨板固定在兔的胫骨上,于手术后4、8、12、24、36周分别观察接骨板周围的纤维膜形成情况和TiNbZr骨界面骨结合情况,并与不锈钢接骨板比较。[结果](1)Ti6Al4V、TiNbZr两种颗粒注入气囊48 h后都能引起TNFα分泌量显著升高(P005),两组比较,Ti6Al4V组明显高于TiNbZr组(P005)。两种材料均不能引起IL6分泌的显著增加(P005)。TiNbZr组气囊囊壁厚度明显小于Ti6Al4V组(P0001)。(2)TiNbZr接骨板周围软组织反应与不锈钢相近。植入后4周,新生骨痂开始覆盖TiNbZr接骨板的两侧,8周时骨痂甚至部分覆盖接骨板和螺钉的表面形成“骨盖板”现象。12周时,骨与TiNbZr接骨板的界面为直接接触,中间无软组织间隔。螺钉与骨也能形成较为牢固的钉骨直接接触。[结论]低弹性模量TiNbZr β钛合金具有优良的体内组织相容性,是一种有前途的骨折内固定材料。
Abstract[Objective]To develop new beta titanium alloys made of titanium, niobium and zirconium (TiNbZr) which have higher strength, lower moduli of elasticity Its biocompatibility in vivo is evaluated in this paper [Method](1) 24 SD rats were used in the modified air pouch model experiments Air was injected subcutaneously on the back of rats to form the pouches and the TiNbZr particles were introduced into them The liquid in the pouches was harvested 48 hours later for IL6 and TNFαELISA procedure and the capsules for histology examination All the results were compared with Ti6Al4V (2) TiNbZr bone plates were fixed onto tibias of rabbits The capsules around the plates and the bone under them were observed at 4, 8, 12, 24 and 36 weeks respectively TiNbZrbone interfaces were emphasized in this procedure This time the control material was stainless steel [Result](1)TiNbZr and Ti6Al4V particles made the air pouches secret more TNFα than that of the control (P005) Ti6Al4V particles made the effect more prominent than TiNbZr particles did (P005) This effect was not seen in IL6 menstruations experiments The thickness of the air pouches was different in two groups It was thinner in the TiNbZr group than that in Ti6Al4V group (P0001)(2)After 4 weeks of TiNbZr bone plates‘ implantation the new callus formed beside the plates The “callus overlay the plate” phenomenon was seen after 8 weeks In 12 weeks a kind of direct integration had formed in the boneplates interfaces No soft tissue was seen in them The same direct integration was also seen in the bonescrew interfaces [Conclusion]The TiNbZr beta titanium alloys developed in this study have lower modulus and high biocompatibility both Its perfect biocompatibility in vivo shows that it is a promising material for internal fixation instruments。
Key words:internal fixaion;titaniumniobiumzirconium;biocompatible materials;in vivo。
作者自行研制了低弹性模量钛铌锆β型(TiNbZr)合金〔1〕,在体外生物相容性实验取得良好结果的基础上,进一步对其体内生物相容性进行进一步的评价。考虑到TiNbZr作为骨折内固定材料的具体应用前景,实验将贾庆卫等 〔3〕的大鼠气囊模型(the air pouch model)应用于TiNbZr材料的生物相容性的评价,并将TiNbZr制成接骨板植入动物体内,观察骨和软组织对该材料的反应,为其临床应用提供更有价值的实验资料。
1材料与方法。
方法参见贾庆卫等〔2〕,人工关节金属磨损颗粒体外制备分离方法的实验研究。
12大鼠气囊模型 (the air pouch model) 的建立。
方法参见贾庆卫等〔3〕,改良大鼠气囊模型在人工关节假体松动研究中的应用。
健康成年SD大鼠24只,随机分为4组,每组6只。分笼饲养2周无疾病表现者进入实验。氯胺酮腹腔麻醉,背部75%酒精消毒,皮下注入空气20 ml, 形成皮丘。48 h后气囊穿刺,再次注入空气10 ml。24 h后分别注入Ti6Al4V、TiNbZr颗粒混悬液5 ml(颗粒浓度25×107/ml),48 h后穿刺抽液,收集囊内液体,75 ℃冻存备用。
囊内液体采用ELISA方法测定IL6和TNFα。测定用ELISA试剂盒购自BioSource USA。操作方法同前。
48 h后大鼠颈椎脱臼法处死,背部正中切口,将气囊完整摘除,4%甲醛固定1周,脱水、透明、石蜡包埋,连续切片,厚度5 μm,常规HE染色,光镜观察。重点观察反应膜中的细胞构成,并按国家标准GB/T 161751996中植入实验炎症细胞反应分级标准进行分级(表1)。
表1GB/T161751996材料植入实验炎症细胞反应分级标准级别炎症细胞反应Ⅰ级试样周围未见或仅见极少量的淋巴细胞Ⅱ级试样周围可见少量淋巴细胞Ⅲ级试样周围有少量嗜中性粒细胞,淋巴细胞和巨细胞反应Ⅳ级试样周围可见以嗜中性粒细胞浸润为主的炎症反应,可见吞噬细胞。
在放大100倍光镜下与显微标尺(10 μm)共同拍照,获得图像输入计算机,利用UTHSCSA ImageTool 300图像处理软件测量囊壁厚度。先利用标尺校准测量长度为10 μm,在囊壁处随机选取6个测量点,则可以读出每个测量点的厚度数值(图1)。
采用317不锈钢和TiNbZr材料分别加工4孔接骨板(接骨板长40 mm,宽7 mm,厚2 mm,螺孔间距22 mm。螺丝钉外径2 mm,内径18 mm,长12 mm,螺帽直径4 mm)。选健康新西兰兔20只,体重25~30 kg。随机分为5组,每组4只。25%戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉后,手术显露双侧胫骨中段,左侧以TiNbZr接骨板内固定(图2a),右侧以317不锈钢接骨板内固定作为对照(图2b)。术后动物分笼饲养,术后应用青霉素3 d,允许自由活动。
分别与手术后4、8、12、24、36周处死,切取接骨板表面软组织4%甲醛固定1周,脱水、透明、石蜡包埋,连续切片,厚度5 μm,常规HE染色,光镜观察。
重点观察反应膜中的细胞构成,并按国家标准GB/T 161751996中植入实验纤维囊腔形成分级标准进行分级。分级标准见表2。
表2GB/T161751996中材料植入实验纤维囊腔形成分级标准级别纤维囊形成Ⅰ级囊腔厚度稳定,无继续增生现象Ⅱ级纤维化囊腔致密,囊腔厚度较形成初期为薄Ⅲ级试样周围可以见到成纤维细胞、纤维细胞与胶原纤维并已形成囊腔结构Ⅳ级试样周围可见小血管、纤维细胞增生并开始形成疏松的囊壁。
拆除接骨板后截取内侧钉孔之间的骨段,4%甲醛固定1周,75%、85%、95%、100%乙醇梯度脱水,透明MMA包埋,硬化后行50 μm切片,常规磨片、抛光、超声清洗。Van Gieson染色:01%甲酸2 min,流水洗涤2 min,20%甲醇2 h,流水洗涤2 min,60 ℃下Stevenol蓝染色15 min,60 ℃蒸馏水2 min,Van Gieson苦味酸品红染色8 min,100%乙醇脱水,中性树脂封片。
光学显微镜下观察,显微摄影数码相机摄取图像。
15统计学分析。
实验测量结果经SAS 612软件处理。组内各参数之间的比较用方差分析,两组比较用q检验,以P005表示差异有显著意义,P001为差异有非常显著性意义。
2结果与分析。
Ti6Al4V、TiNbZr两种颗粒注入气囊48 h后都能引起TNFα分泌量显著升高(P005),两组比较,Ti—6AI—4V组明显高于钴铬钼组和TiNbZr组(P005)。
2种材料组的IL6分泌量对照组(钴铬钼)比较,但各组间无显著差异(P005)(表3)。
表3钴铬钼、Ti—6AI—4V、TiNbZr气囊 TNFα。
和IL6分泌量的比较(pg/ml)分组对照(钴铬钼)组Ti—6AI—4V组TiNbZr组TNFα1287±6642*16406±5623**8739±8236IL618898±3326△27297±461930035±4947*TNFα,对照组与每个实验组比较P005;**TNFα,Ti6Al4V和TiNbZr组比较P005;△IL6,对照组与每个实验组比较P00522大鼠气囊模型对各种金属颗粒的组织学反应观察。
Ti6Al4V组囊壁明显增厚,可见少量的中性粒细胞和嗜碱性粒细胞,炎症细胞反应为III级(图3)。
气囊囊壁厚度:Ti6Al4V组 TiNbZr组空白对照组。两两比较,每两组间均有明显差异P0001(表4)。
表4各种金属材料气囊囊壁厚度测量数值 (μm)组别分组N囊壁厚度(x±s)1空白对照361650750±1878582钛铝钒368308600±8374553TiNbZr364758420±785791。