胃癌—树突状细胞融合细胞疫苗制备及其形态学观察
作者：张坤 余佩武 高朋芬 饶云。
［摘 要］ 目的 利用细胞融合技术，获取胃癌细胞—树突状细胞融合细胞疫苗，并对其形态学特点进行观察，为基于树突状细胞（DC）的融合疫苗研究及应用提供实验基础。 方法 利用聚乙二醇（PEG）诱导胃癌细胞、DC融合，HAT、HT筛选培养系统对融合细胞进行筛选培养，获取纯净融合疫苗;利用光镜、电镜对其形态学特点进行观察。 结果 胃癌—DC细胞融合后，体积明显增大，悬浮生长，细胞表面树枝状突起较亲代DC明显短小、稀少。 结论 胃癌—DC融合细胞保持类似于亲代DC的悬浮生长特性，但数量减少、体积明显增大，具备与两种亲代细胞均不相同的形态学特性。 ［关键词］ 胃癌细胞;树突状细胞;融合细胞疫苗;形态学 Preparation and morphological characteristics of gastric cancer cell—dendritic cell fusion vaccine Abstract:Objective To obtain gastric cancer cell—dendritic cell fusion vaccine by using the cell fusion technology and to observe the morpho—logical characteristics of the fusion cells.Methods The gastric cancer cells and dendritic cells were fusioned by PEG and selected by the HAT.HT culture systems.The morphological characteristics of the fusion cells were examined under light and electron microscopes.Results The fusion cells became much larger than their parental cells，but the cell number decreased remarkably.The fusion cells less in suspended in the culture medium and the protuberances on the surface of the cells became short and sparse.Conclusion The gastric cancer cell—dendritic cell fusion cells kept the growth feature of suspension as their parental dendritic cells，but were much larger and less in number.These morphological characteristics are typi—cal and different from their parental cells. Keywords:gastric cancer cell;dendritic cell;fusion vaccine;morphology 胃癌是严重威胁人类健康的常见消化道恶性肿瘤之一，近年来生物治疗手段的不断完善与发展为改善胃癌患者的预后带来希望。各国学者利用细胞免疫和基因工程技术，进行各种肿瘤疫苗的研究，尤其是基于DC的抗肿瘤疫苗研究，取得了许多可喜的成就。既往基于树突状细胞（DC）的抗肿瘤疫苗研究主要有:用癌细胞冻融［1］ 、超声粉碎［2］ 等方法获取癌细胞裂解产物，将其作为粗提抗原刺激DC，将癌细胞抗原决定簇mRNA转入DC，将DC与癌细胞混合培养等。上述多种手段虽都能在一定程度上增强DC的功能，并增强机体的抗肿瘤免疫能力，但其本身仍存在许多局限性。为此，本实验尝试利用细胞融合技术，将DC与胃癌细胞进行融合制备融合细胞疫苗，并对其形态学变化特点进行观察。希望能为胃癌DC瘤苗的研究提供新的实验基础。 1 材料与方法。
1.1 主要试剂 DMEM培养基（Gibcol Brl），淋巴细胞分离液（TDB公司），rhGM—CSF（Promega），rhIL—4（RD System），TNF—α（RD System），聚乙二醇（Polyethylene glycol，Sigma），次黄嘌呤（Hypoxanthine，Sig—ma），氨基喋呤（Aminopterin，Sigma），胸腺嘧啶核苷（Thymidine，Sigma），MEM培养基（Gibcol）。
1.2 实验方法 1.2.1 配制DMEM培养基、MEM培养基。
1.2.2 50%PEG配制 PEG2.0g，放入青霉素小瓶，加胶塞并插一针头，8磅高压蒸汽灭菌15min后取出;56℃水浴中融化，37℃水浴;配制好的MEM培养基37℃水浴;吸取1ml PEG+1ml MEM，37℃水浴充分混匀。
1.2.3 HAT选择性培养系统 100×HT:50ml去离子水+68mg次黄嘌呤（H）+19mg胸腺嘧啶核苷（T），70℃水浴助溶使充分溶解。100×A:50ml去离子水+0.88mg氨基喋呤（A），加1.0mol.L NaOH0.25ml助溶，1mol.L HCl调节pH值至7.4。HAT选择性培养液:DMEM完全培养基100ml+HT母液1ml+A母液1ml，0.75%NaHCO3 调节pH值至7.2～7.4。HT选择性培养液:DMEM完全培养基100ml+HT母液1ml，0.75%NaH—CO3 调节pH值至7.2～7.4。
1.2.4 SGC7901胃癌细胞复苏培养 取冻存SGC7901细胞，快速37℃水浴复苏加DMEM完全培养基，37℃、饱和湿度、5%CO2 孵箱静置培养。
1.2.5 胃癌患者外周血DC分离培养 应用淋巴细胞分离液分离无菌、肝素钠抗凝胃癌患者外周全血中单个核细胞层。加DMEM完全培养基，37℃、饱和湿度、5%CO2 孵箱静置培养。2.5h后吸除培养基，去除未贴壁细胞，更换培养基并加入细胞因子rhGM—CSF100ng.ml、rhIL—450ng.ml。静置培养6d后，加入TNF—α20ng.ml，第7天收获DC。 1.2.6 SGC7901—DC融合细胞疫苗制备 制备SGC7901均匀单细胞悬液，细胞密度为1×108 .ml。制备DC单细胞悬液，细胞密度为1×107 .ml。SGC7901单细胞悬液与DC单细胞悬液10∶1比例均匀混合。1000r.min离心10min，向细胞沉淀中缓慢滴加1ml PEG溶液，吸管轻柔吹打，使细胞混合均匀。静置1min，使两种细胞充分接触、融合。加9ml MEM培养基终止融合，离心沉淀（800r.min，8min），弃上清，加DMEM完全培养基，37℃、饱和湿度、5%CO2 孵箱静置培养24h。更换成HAT选择性培养液，静置培养14d。更换成HT选择性培养液，筛选培养7d。收获纯净融合细胞疫苗。 1.2.7 DC及融合细胞疫苗形态学观察 取均匀悬浮生长DC，倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜形态学特点观察。取生长良好、经HAT.HT选择培养系统筛选培养的融合细胞，倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜形态学观察。 2 结果 2.1 培养SGC7901胃癌细胞形态观察 SGC7901胃癌细胞复苏培养后第2天，即恢复良好的贴壁生长，但细胞数量仍较少，表明细胞处于复苏培养后的短暂潜伏适应期。约培养4d后，细胞数量逐渐增多，细胞膜清晰、完整，细胞主要呈椭圆形、短梭形生长。随时间推移，细胞分裂增殖，数量显著增多。复苏培养第7天，细胞处于旺盛生长状态，透射电镜观察，可见细胞膜清晰完整，细胞突起短而细小，细胞核大，核浆比例大，胞浆内线粒体丰富，染色质呈棒状或分叶状，表明细胞分裂增殖、生长活跃。扫描电镜观察，可见细胞呈现不同大小的椭圆形或短梭形，表面未见明显突起。