UHPLC―MS/MS法测定雷公藤甲素人血浆蛋白结合率
方法 采用UHPLC—MS/MS法测定透析内液及外液中雷公藤甲素浓度，同时估算其与人血浆的蛋白结合率。
结果 雷公藤甲素的线性关系、精密度与准确度、提取回收率和稳定性均符合方法学要求。
实验结果表明，雷公藤甲素低、中、高（0.8、0.4、0.2 μg/mL）3个浓度中，雷公藤甲素的人血浆蛋白结合率分别为（88.61±1.45）%、（89.28±2.64）%、（88.67±1.59）%。
毕业论文网 [关键词] 雷公藤甲素；血浆蛋白结合率；平衡透析法；超高效液相串联质谱 [中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1673—7210（2016）07（c）—0046—04 雷公藤甲素（Triptolide）为卫矛科木质藤本植物雷公藤（Tripterygium wilfordii）中分离得到的环氧化二萜内酯类成分，是雷公藤中的活性成分之一[1—3]。
现代药理学研究表明，雷公藤甲素具有一系列药理活性，如抗炎、抗肿瘤、免疫抑制等药理作用[4—7]，其中其显著的抗肿瘤活性越来越得到临床的认可，是潜在的抗肿瘤候选药物。
但是，雷公藤甲素治疗窗十分小，同时，在临床治疗中常常出现多种不良反应。
另外，有研究表明，雷公藤甲素不仅是雷公藤制剂的有效成分而且也是有毒成分[8—10]。
药物血浆蛋白结合率是药动学主要参数之一，和药物的疗效有重要的关系。
本试验采用平衡透析法研究雷公藤甲素在人血浆蛋白中的结合率，并建立UHPLC—MS/MS法测定雷公藤甲素在人血浆中的浓度，为进一步开展药代动力学研究提供借鉴。
1 仪器与材料 Agilent G6430 LC—MS/MS液质联用仪（美国Agilent公司，所配高效液相仪为Agilent 1290）；MassHunter数据处理系统（version B.05.00）；CentriVap离心浓缩仪（美国照生公司）；WH—2微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；十万分之一电子天平（德国赛多利斯公司）；Maxima 超纯水机（美国基因公司）；Biofuge PrimoR冷冻高速离心机（德国Heraeus公司）；透析袋（美国联合碳化公司，14000 D，压平宽度25 mm）；病毒灭活冰冻人血浆（江苏省血液中心）。
对照品雷公藤甲素（批号111567—201404，中国食品药品检定研究院）、泼尼松龙（批号100153—201405，中国食品药品检定研究院）；实验用水为哇哈哈纯净水。
2 方法 2.1 色谱质谱条件 Phenomenex Gemini C18色谱柱（3 μm，100 mm×2.0 mm）；流动相：甲醇—0.1%冰醋酸水溶液（含2 mmol/L醋酸铵）=75∶25；流速：200 μL/min；柱温：35℃；进样体积：2 μL。
离子源：电喷雾电离源（ESI）；正离子方式检测；定量模式：多反应监测（MRM）；干燥气温度：400℃；毛细管电压：4000 V；雷公藤甲素的裂解电压（Fragmentor）及碰撞电压（CE）值分别为90、5 V；泼尼松龙（内标）的Fragmentor及CE值分别为100、20 V。
检测对象：雷公藤甲素m/z 378.2→m/z 361.1；内标m/z 361.3→m/z 147.0。
2.2 溶液的配制 2.2.1 空白PBS溶液制备 精密称定2.70 g KH2PO4、18.31 g K2HPO4?3H2O、11.18 g KCl，置于1 L容量瓶中，超纯水稀释并定容至1 L，得pH=7.4的PBS溶液[11—12]。
2.2.2 制备对照品储备液 精密称定雷公藤甲素10.12 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，超声10 min，摇匀，即得浓度为1012 μg/mL雷公藤甲素储备液；精密称定泼尼松龙10.04 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，超声10 min，摇匀，即得浓度为1004 μg/mL内标储备液。
2.2.3 制备透析外液 分别精密称定雷公藤甲素8、4、2 mg，加入适量PBS溶液溶于1 L容量瓶，超声30 min，PBS溶液定容至刻度，摇匀，分别取上述溶液适量，用PBS溶液稀释10倍，即得浓度为0.8、0.4、0.2 μg/mL的透析外液。
2.3 样品处理 2.3.1 透析内液（血浆） 吸取100 μL透析内液样品，加入浓度为1 μg/mL内标泼尼松龙10 μL，震荡30 s，加入萃取溶剂乙酸乙酯1.5 mL，震荡5 min，12000 r/min离心5 min，移出上清液。
30℃下氮气吹干，100 μL 75%甲醇复溶，震荡5 min，12 000 r/min离心5 min，2 μL上清液进行LC—MS分析。
2.3.2 透析外液（PBS） 吸取透析外液100 μL，按“2.3.1”项下操作流程处理。
2.4 平衡透析试验 透析袋预处理后备用，将其中一端扎紧，并加入1 mL空白人血浆，扎紧透析袋的另一端，同时袋内保留部分空气，将扎好的透析袋置于装有30 mL含雷公藤甲素PBS溶液的带盖玻璃瓶中，调节透析袋的位置，保证袋内血浆与袋外PBS溶液液面一致，保证透析袋不接触瓶壁，将玻璃瓶放入4℃冰箱中。
当透析袋内外液药物扩散平衡后，透析实验即结束，实验结束后使用10%高氯酸溶液检测袋外PBS溶液，验证袋内血浆蛋白是否漏出。
3 结果 3.1 专属性 在本实验检测方法下，雷公藤甲素和内标的保留时间分别约为1.17、1.12 min，未发现有其他物质干扰检测，见图1。