小凹蛋白在清道夫受体AI介导的巨噬细胞源性泡沫细胞形成过程中的

作者：王蓉蓉，朱炳阳，严鹏科，廖端芳。

【关键词】 小凹;蛋白；清道夫受体AI；氧化性低密度脂蛋白；巨噬细胞；泡沫细胞。

Role of caveolin1 in SRAI mediated formation of foam cells derived from macrophages。

【Abstract】 AIM： To investigate the role of caveolin1 in scavenger receptor ai (SRAI) mediated formation of macrophagederived foam cells induced by oxidized lowdensity lipoprotein (oxLDL). METHODS: RAW 264.7 macrophages were treated with 75 mg/L oxLDL for different hours. Next, macrophages were pretreated with SB202190 and SRAI antisense oligonucleotides before 75 mg/L oxLDL treatment for 24 h. Western blot analysis was used to detect protein expression. High performance liquid chromatography (HLPC) analysis was performed to determine the cellular cholesterol content. Oil red O staining was used to show the lipid droplets in foam cells. RESULTS: Western blot analysis showed that SRAI expression increased with 75 mg/L oxLDL treatment for 12, 24 and 48 h. 75 mg/L oxLDL treatment for 6, 12, 24, 48 and 96 h decreased the expression of caveolin1. When oxLDL treatment was over 24 h, descended expression of caveolin1 in macrophages was observed and lasted for 96 h. Pretreatment of SB202190 and SRAI antisense oligonucleotides decreased the expression of SRAI and increased the expression of caveolin1. Meanwhile, the cellular cholesterol content was also decreased (P0.01 vs oxLDL treatment groups). Oil red O staining showed that the SB202190 pretreatment group and SRAI antisense oligonucleotides group formed less lipid droplets than oxLDL treatment group did. CONCLUSION: There appears a negative relationship between caveolin1 and SRAI during the accumulation of lipidladen foam cells.

【Keywords】 Caveolae; caveolin1; Scavenger receptor AI; Atherosclerosis; Oxidized lowdensity lipoprotein; cholesterol; macrophage。

【摘要】 目的：研究小凹蛋白在清道夫受体AI介导的巨噬细胞源性泡沫细胞形成过程中的作用. 方法：用75 mg/L氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)与巨噬细胞共同孵育不同时间. 清道夫受体AI反义寡核苷酸、P38阻断剂SB202190预处理巨噬细胞，然后给予75 mg/L oxLDL处理24 h. Western blot法检测清道夫受体AI和小凹蛋白的表达. 高效液相色谱法检测细胞内胆固醇的含量，油红O染色观察细胞内脂滴的形成情况. 结果：经75 mg/L oxLDL处理巨噬细胞不同时间，oxLDL呈时间依赖性促进清道夫受体AI的表达，而呈时间依赖性抑制小凹蛋白的表达. 用清道夫受体AI反义寡核苷酸抑制清道夫受体AI的表达，小凹蛋白的表达明显增加. 该组细胞内胆固醇含量为（119±7） mg/g，与oxLDL处理组比较显著减少（P0.01)，细胞内脂滴亦明显减少. P38MAPK抑制剂SB202190能明显抑制清道夫受体AI的表达，而增加小凹蛋白的表达. SB202190处理组细胞内胆固醇含量为（173±14） mg/g，与oxLDL处理组比较显著减少（P0.01），细胞内脂滴亦明显减少. 结论：小凹蛋白与清道夫受体AI协同参与了oxLDL诱导的巨噬细胞泡沫化的形成过程.

【关键词】 小凹;蛋白；清道夫受体AI；氧化性低密度脂蛋白；巨噬细胞；泡沫细胞。

0引言。

泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化发生发展的核心环节. 巨噬细胞和平滑肌细胞表面的清道夫受体AI（scavenger receptor AI, SRAI）能不断摄取修饰的脂蛋白，致使胆固醇及胆固醇酯在细胞内聚集，是泡沫细胞形成的重要机制之一［1］. 同时，氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）损伤细胞的胆固醇自平衡机制，抑制胞内胆固醇流出，是泡沫细胞形成的另一重要机制［2］. 但细胞摄取胆固醇和胆固醇酯的同时，为什么会导致胆固醇流出障碍尚不清楚. 小凹（Caveolae）及小凹蛋白（caveolin1）是存在于细胞膜上的特异性内陷结构，在介导细胞内胆固醇的转运和流出、维持细胞内外胆固醇平衡过程中起着重要的作用［3—4］. 本研究我们探讨了小凹蛋白在SRAI介导的巨噬细胞源性泡沫细胞形成过程中的作用.

1材料和方法。

1.1材料小凹蛋白1抗体(sc2894，Sigma公司，美国)、 SRAI（2F8）抗体（Serotec公司, 英国）； P38阻断剂SB202190（Calbiochem公司，美国）. 其他试剂均为国产分析纯. 鼠源单核细胞源性巨噬细胞RAW264.7细胞（中科院上海细胞生物所细胞中心）；蛋白电泳系统（美国Bio Rad公司）；80P7型超速离心机（日本Hitachi公司）； 高效液相色谱仪（美国惠普公司）； 自动凝胶成像系统（美国UVP公司）.

1.2方法。

1.2.1RAW264.7细胞培养及分组用含100 mL/L小牛血清的DMEM培养液调细胞密度至1×107/L，24 h后换入1 mL/L小牛血清的DMEM培养液，处理前细胞静止24 h. 实验分为：空白对照组、oxLDL处理组、SRAI正义寡核甘酸处理组、SRAI反义寡核甘酸处理组及SB202190处理组.

1.2.2低密度脂蛋白的制备及修饰正常人血浆低密度脂蛋白采用序列超速离心法制备［5］. 所得天然低密度脂蛋白置于PBS溶液中，4℃透析36 h；再放入含10 μmol/L CuSO4的PBS溶液（pH 7.2），37℃透析20 h进行氧化修饰. oxLDL置于100 μmol/L EDTA的PBS中，4℃透析24 h，终止氧化.

1.2.3SRAI寡核苷酸的设计和合成SRAI反义寡核苷酸（SRAI ASODN） 序列为：5′TACCTCGTCACCCTAGTGAAA3′. 为了排出SRAI ASOND可能的非特异性作用，设立了SRAI正义寡核苷酸（SRAI NSOND）对照序列. SRAI NSOND的序列为：5′ATGGAGCAGTGGGATCACTTT3′. 寡核苷酸均进行全硫代磷酸化修饰，由上海生工生物工程公司合成. 使用时SRAI ASOND和SRAI NSOND的终浓度均为10 μmol/L.

1.2.4Western blot印迹法检测小凹蛋白及SRAI蛋白表达收集细胞, 4000 g离心，BCA试剂测定蛋白含量，用10 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜，封闭；按1∶1000加入鼠抗人cavelin1一抗或按1∶100加入鼠抗人SRAI（2F8）一抗，4℃过夜；1∶2000加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗，室温1 h；显影. 用Labworks图像分析系统对Western blot结果进行吸光度扫描并分析.

1.2.5油红O染色将细胞培养于预先放有无菌盖玻片的6孔培养板，处理结束后用PBS冲洗盖玻片3次，每次5 min，500 mL/L异丙醇固定1 min，油红O染色10 min，蒸馏水冲洗3次，每次1 min，苏木素染色5 min，分色和返蓝后，HPIAS1000型图像分析系统收集图像.

1.2.6细胞内胆固醇的检测待细胞处理结束后，PBS洗3遍，加入1 μmol/L NaOH 500 μL,反复冻融3次裂解细胞，蛋白定量后，7.2 g/L三氯乙酸沉淀蛋白，800 g离心10 min，留上清进行胆固醇检测. 以豆甾醇为内标并作标准曲线，取100 μL上清液，加入8.9 mol/L KOH溶液200 μL，水解胆固醇酯后为细胞内总胆固醇样品. 各样品分别与内标样混匀，用正已烷和无水乙醇抽提后，1.5 mol/L的三氧化铬进行氧化衍生并真空干燥，100 μL乙晴异丙醇（80∶20）溶解样品，上样于高效液相色谱仪. 采用C18柱，柱温4℃，流速1 mL/min, 250 nm紫外光检测，胆固醇以峰面积定量，内标校准，以细胞蛋白中的含量mg/g为单位.统计学处理： 实验数据以x±s表示，由SPSS 13.0统计软件完成.