氧化苦参碱在大鼠肾间质纤维化进程中的保护作用
作者：姚钢炼，宁宁，高登峰，桂保松。
【关键词】; 氧化苦参碱；纤维化；肾间质；转化生长因子 毕业论文。
摘要：目的; 探讨氧化苦参碱对大鼠肾间质纤维化进程的干预作用，并阐明其部分机制。方法; 40只雄性SD大鼠，随机分为假手术组、模型组、苯那普利组、氧化苦参碱大剂量组和小剂量组。以单侧输尿管结扎术建立输尿管梗阻的动物模型。术后第14天取术侧肾组织行HE、Masson染色及转化生长因子1(TGF1)、平滑肌肌动蛋白(SMA)和Ⅲ型胶原(ColⅢ)免疫组化检测，并运用图像分析系统做半定量分析。结果; 经氧化苦参碱干预后，梗阻侧肾脏的SMA 、TGF1和ColⅢ的表达均显著低于模型组(P0.01)；大剂量氧化苦参碱组均低于苯那普利组(P0.05)；氧化苦参碱大剂量组和小剂量组之间无显著性差异(P0.05)。结论; 氧化苦参碱可能是通过降低TGF1等细胞因子的表达而减少细胞外基质(ECM)产生细胞的活化，从而减少ECM的沉积，达到抗肾间质纤维化的作用。 毕业论文。
关键词：氧化苦参碱；纤维化；肾间质；转化生长因子；肌成纤维细胞。
毕业论文。
The protective function of oxymatrine on renal interstitial fibrosis in rats。
毕业论文。
ABSTRACT: Objective; To investigate the protective function of oxymatrine on the renal intestitial fibrosis in rats. Methods; Forty male Sprague Dawley rats were randomly divided into 5 groups: sham group, model group, Lotensin group, largedose oxymatrine group, and smalldose oxymatrine group. The models were established by unilateral ureteral obstruction(UUO) of the left side. On the 14th day after operation, the obstructed kidney was taken out. Then, HE, Massion, and immunohistochemistry staining of transforming growth factor1(TGF1), smooth muscle acting (SMA) and collagen Ⅲ were conducted. After that, semiquantitative analysis was performed. Results; After oxymatrine, treatment, the expressions of SMA, TGF1 and ColⅢ of the obstructed kidney in the treatment group were significantly lower than those in the model group (P0.01); the expressions in the largedose oxymatrine group were lower than those in the lotensin group; while there were no significant difference between the largedose and smalldose oxymatrine groups (P0.05). Conclusion; Oxymatrine may reduce the expression of cytokines such as TGF1, then the activation of cell producing ECM and then the sendimentation of ECM, thus preventing renal interstitial fibrosis. 毕业论文。
KEY WORDS: oxymatrine; fibrosis; renal interstitium; transforming growth factor&beta myofibroblast。
毕业论文。
肾间质纤维化几乎是所有慢性肾脏疾病发展的最终结果，是导致慢性肾衰竭的主要原因之一[1]。肾小管间质细胞表型转化、致纤维化细胞因子过度表达、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成降解失衡及大量积聚等因素在肾间质纤维化的发生、发展过程中起着重要作用。因此,寻找针对肾间质纤维化发生机制的药物,将是防治肾间质纤维化、延缓尿毒症发生的有效措施。氧化苦参碱是苦参型生物碱的主要活性成分，具有多方面的药理作用和功效。已有研究发现，氧化苦参碱对肝脏、皮肤及心肌纤维化具有防治作用[2]，但其对肾间质纤维化的作用还未见报道。本实验运用大鼠单侧输尿管结扎术(unilateral ureteral obstruction, UUO)建立肾间质纤维化动物模型,给予大鼠氧化苦参碱灌胃,通过观察肾间质病理变化，测定转化生长因子1(transforming growth factor1，TGF1)、平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin, SMA)以及Ⅲ型胶原(Collagen Ⅲ, ColⅢ)的合成表达情况，探讨氧化苦参碱对大鼠肾间质纤维化的影响。 毕业论文。
1; 材料与方法 毕业论文。
1.1; 实验动物及分组 雄性 SD大鼠40只，清洁级，体重180—200g，由西安交通大学动物实验中心提供。随机分为5组，每组8只，分别为：假手术组(A组)：蒸馏水 10mL/(kg・d)；模型组(B组)：蒸馏水10mL/(kg・d)；苯那普利组(C组)：苯那普利10mg/(kg・d)，北京诺华制药有限公司；氧化苦参碱大剂量组(D组)：氧化苦参碱100mg/(kg・d)，西安鸿生生物技术有限公司；氧化苦参碱小剂量组(E组)：氧化苦参碱50mg/(kg・d)。各组于术前1d开始灌胃给药。
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1.2; 造模方法; UUO致肾小管间质纤维化模型参照文献[3]。A组打开腹腔后分离左侧输尿管，并不结扎即关闭腹腔。术后第14天处死各组大鼠，取梗阻侧肾脏，用10%(体积分数)中性甲醛固定。 毕业论文。
1.3; 免疫组织化学染色; 采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶法(SP法)。2m厚的石蜡切片常规脱蜡水化，用含3%(体积分数)H2O2的甲醇封闭内源性过氧化物酶(抗原修复采用煮沸法)。正常山羊血清封闭液室温封闭20min后，分别加小鼠抗人SMA单克隆抗体(1∶50，北京中山公司，适用于人、大鼠、兔)，兔抗大鼠TGF1多克隆抗体(1∶50，Santa Cruz，美国)，小鼠抗人ColⅢ单克隆抗体(1∶50，北京中山公司，适用于人、大鼠、兔)，4℃冰箱过夜。再加生物素标记的山羊抗兔Ⅱ抗(TGF1)或山羊抗小鼠Ⅱ抗(SMA，ColⅢ)(北京中山公司)，37℃孵育30min，链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶37℃ 30min，DAB显色3min，蒸馏水冲洗终止显色。苏木素复染核2min，自来水冲洗，常规脱水、透明、封片。同时用正常血清作阴性对照。 毕业论文。
1.4; 肾小管间质病理评分; Masson染色后，在低倍镜下(100)依序单盲(观察者不知标本来源的差异性)观察左上、右上、左下、右下、中间5个肾间质视野，分别计算肾脏组织间质损伤指数、纤维化指数、细胞浸润程度评分[4]，然后分别计算各个评分的均值。 毕业论文。
1.5; 图像分析; 采用Qwin550CW型图像信号采集与分析系统(Leica，德国)，分别对各组免疫组化染色的肾脏标本切片进行灰度值测量。每组测量来自不同个体的8张组织切片，高倍镜下(400)每张切片分别取2个视野，每个视野面积约为0.1mm2。测量时每个视野随机测量4个随机面积内阳性显色的平均灰度值，每组共测量64(824)个数据。灰度值越高表明相应蛋白表达越低，反之则表明相应蛋白表达越高。
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1.6; 统计学处理; 数据均采用(s)表示，用SPSS12.0统计软件进行统计分析。组间差异比较用单因素方差分析，两两比较用SNKq检验，以P0.05为有统计学意义。 毕业论文。
2; 结果 毕业论文。
2.1; 肾组织病理改变; 肾组织HE及Masson染色显示，B组间质大量炎性细胞浸润和纤维组织增生，部分肾小管萎缩、管腔闭塞或扩张、坏死，小管间质区面积扩大，小管基底膜不同程度断裂增厚；C、D、E组间质可见少量的炎性细胞浸润，少量纤维组织增生，肾小管轻度扩张。 毕业论文。
2.2; 肾间质病理评分; C、D、E组肾间质损伤指数、间质纤维化指数、间质炎性细胞浸润程度均显著低于B组(P0.05)，而C、D、E组间无显著性差异(表1)。 毕业论文。
表1; 各组肾脏组织的间质损伤指数、纤维化指数及细胞浸润程度比较（略）。
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Table 1; Renal interstitial damage index, fibrosis index,and cellular infiltration level of each group 毕业论文。
*P0.01 vs. sham, △P0.01 vs. model 毕业论文。
2.3; 肾组织内SMA表达; 镜下可见，A组SMA只在正常肾组织血管壁上表达，小球和小管中无阳性染色；B、C、D、E组除血管壁上有表达外,可见大量的阳性细胞出现在肾间质中，同时部分小管上皮细胞胞浆内也出现阳性棕黄色染色颗粒，其中以B组更为明显。各组大鼠肾小球内均无明显SMA阳性染色。免疫组化半定量结果统计分析示，B、C、D、E组肾脏SMA蛋白表达显著高于A组(P0.01)，C、D、E组显著低于B组(P0.01)，D、E组又低于C组(P0.05，表2，图1)。 毕业论文。