应用荧光光谱法研究丁香酸与鱼精DNA的发展综述分析

引 言 　　DNA作为生物遗传物质，是生物体内主要的生物大分子之一，同时也是众多药物的主要标靶。药物进入体内后与DNA的相互作用，会影响DNA本身的复制和合成等性质，因而小分子药物与DNA相互作用研究近年来越来越受到人们重视[[1，2]。有机酸是中药中的一大类有效成份，同时也广泛分布在植物、水果和蔬菜中，它们与生物大分子的相互作用日益受到关注[3～5]。Sroka[6]等研究多酚酸的抗氧化活性，发现羟基数多的多酚酸抗氧化活性要大于羟基数少的多酚酸。丁香酸属于苯甲酸衍生物，经常在板蓝根等一些植物的提取液中找到，具有消炎、抗菌、抗氧化等作用[7]。 　　图1 丁香酸 syringic acid 　　对小分子药物与DNA相互作用的研究近年来已经成为生物、化学等众多领域的研究热点问题之一，该领域的研究有助于人们从分子水平认识药物DNA相互作用方式，对于研究小分子的生物活性及药物作用机理、对以DNA为靶标的药物分子筛选和设计等都有重要意义。本文通过荧光光谱法研究丁香酸和鱼精DNA的相互作用，判定二者相互作用形成复合物，并计算出结合常数，为从分子水平认识丁香酸与DNA的相互作用提供重要信息。 　　1 实验部分 　　1.1 仪器与试剂 　　荧光光谱仪，法国JY公司 Fluorolog—TAU—3 荧光光谱仪。 毕业论文 　　试剂：鱼精DNA（Fish sperm DNA，fsDNA）（北京鼎国生物技术有限公司，Sigma公司分装）；丁香酸（纯度97%）（sigma公司）； NaH2PO4（北京红星化工厂，分析纯）；NaOH（分析纯，北京化学试剂公司）；实验用水为Milli—Q超纯水。 　　溶液配制：配置0.02 mol?L—1NaH2PO4缓冲液溶解，用NaOH调节pH为7.4，所有的鱼精DNA和丁香酸溶液均用该缓冲溶液配置。荧光光谱测量中鱼精DNA的浓度以ε260 = 6600L?mol—1?cm—1确定[8]，测定二者相互作用光谱时保持丁香酸浓度为10—5mol?L—1；加入DNA溶液和药物具有一系列浓度比例，C fsDNA /C药物依次为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0。 　　1.2 实验内容 　　荧光光谱测量：以280nm为激发波长，记录300～500nm范围内丁香酸及其与一系列不同浓度fsDNA混合溶液的荧光发射光谱。 　　2 结果与讨论 　　2.1 丁香酸与DNA相互作用前后的荧光光谱特征 　　通常情况下丁香酸的紫外吸收光谱在190—350nm范围内主要有3个吸收带，位于190—230nm处的强吸收带属于K吸收带，位于230—270nm处的较弱吸收带是B吸收带，以及位于270—310nm处的较弱吸收带属于R吸收带。K吸收带的波长、强度与共轭体系的数目、位置、取代基的种类有关。从结构上看，由于有助色团—OH、—OCH3的影响，SY在204—210nm吸收峰是苯骨架结构E2和K的合并吸收带；受溶剂磷酸缓冲液极性和取代基的影响，SY的B吸收带精细结构消失，形成一个宽峰；溶剂极性大使n*吸收带蓝移，助色团—OH、—OCH3使吸收带红移，两种作用的影响使SY的R吸收带消失，与B吸收带合并成一个宽峰。

思想汇报 /sixianghuibao/ 　　DNA分子具有吸收250280nm波长紫外光的特性，其吸收峰值在260nm左右，在280nm处吸收值很小，对于丁香酸本身的荧光发射几乎不造成干扰。因此选择DNA做猝灭剂，以280nm为荧光激发波长，通过丁香酸荧光发射峰的变化可以研究DNA与药物的相互作用。 　　pH 7.4的磷酸缓冲液中，280nm激发波长下，丁香酸在351nm处有较强的荧光发射峰。鱼精DNA（fsDNA）的紫外光谱的最大吸收在260nm左右，在280nm激发波长下，在370nm左右有弱的荧光发射峰（见图1）。当药物分子与fsDNA发生相互作用时，药物荧光发射强度被明显的猝灭，其猝灭程度随fsDNA浓度的增加而增大（见图1）。这种药物荧光发射峰的强度被DNA明显猝灭的现象能够直观地说明二者之间发生了相互作用。但是这种相互作用，仅仅是由于分子间碰撞引起的静态猝灭，还是二者之间发生相互结合而引起的动态猝灭，这还需要进一步研究验证。 　　2.2 DNA对药物的荧光猝灭参数研究 　　2.2.1 速率常数 荧光猝灭的机制有动态猝灭和静态猝灭之分，通过判定猝灭机制可以明确地判定出药物与DNA分子之间是否发生了相互的结合，对于研究药物小分子与生物大分子之间的相互作用机制具有重要的意义。一般来说各类猝灭剂对荧光发色团的最大动态扩散猝灭常数kQ为2.01010 L?mol—1?s—1，如果kQ小于该猝灭常数，则猝灭机理主要是动态猝灭；当kQ大于该猝灭常数，说明猝灭机理包括静态猝灭[9]。如果kQ大于最大动态扩散常数2—3个数量级，则主要为静态猝灭机理。 总结大全 /html/zongjie/ 　　如果荧光分子与猝灭剂之间发生的是动态猝灭，那么它们应该服从Stern—Volmer方程[10]： 　　（1） 　　其中F0、F分别药物与猝灭剂作用前后的荧光强度，[Q]为猝灭剂浓度，0为猝灭剂不存在时荧光体的寿命，KQ为双分子猝灭过程速率常数，KD为Stern—Volmer常数。从方程可以看出，用猝灭剂浓度[Q]对F0/F作图应该成线性，根据直线的斜率即可计算出KD，进而可以计算得到荧光猝灭速率常数KQ。　根据Stern—Volmer方程，计算出丁香酸与fsDNA相互作用的猝灭速率常数。从图2中看出，在实验浓度范围内，F0/F与fsDNA浓度[Q]之间并不完全呈线性关系，在较高浓度时向上弯曲。首先在4C fsDNA /CSY32范围内二者是直线关系，根据直线的斜率可以计算出fsDNA对SY的荧光猝灭速率常数为1.521012L?mol—1?s—1，远远大于动态猝灭的最大扩散猝灭常数2.01010 L?mol—1?s—1，说明在该浓度范围内，fsDNA对丁香酸的荧光猝灭主要为静态猝灭机理，也就是说此时fsDNA与药物分子之间相互结合形成了不发荧光的基态复合物。当fsDNA浓度进一步升高时，Stern—Volmer曲线向上弯曲，说明此时fsDNA对丁香酸的荧光猝灭已经不符合动态猝灭机理，这是因为任何化学反应中反应物之间都存在特定的比例，而fsDNA的浓度已经大大超出二者结合的比例，在其对丁香酸的荧光猝灭中除动态猝灭还存在诸如静态猝灭、非辐射能量转移等多种猝灭机理共存。 代写论文 　　2.2.2 结合常数 从上文的分析中可以看到，在4C fsDNA /CSY32浓度范围内，fsDNA对丁香酸的荧光猝灭符合静态猝灭机理，根据静态猝灭理论[11]即 　　（2） 　　以lg（（F0—F）/F）对lg[Q]作图，便可求得药物与fsDNA分子的结合常数KA和结合数n。 　　丁香酸与fsDNA的结合位点数通过lg（F0—F/F）=lgK。

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