大黄酚对β淀粉样蛋白25～35致小鼠学习记忆障碍的改善作用
作者：武海霞 张丹参 张力 安芳 薛贵平 王树。
【摘要】 目的 研究大黄酚对凝聚态β淀粉样蛋白25～35(Aβ25～35)致小鼠学习记忆障碍的改善作用,探讨其可能的作用机制。方法 采用一次性小鼠右侧脑室注射Aβ25～35 3 μl造成学习记忆障碍动物模型，应用避暗实验、Morris水迷宫实验观察大黄酚(0.1，1.0,10.0 mg/kg)腹腔内注射对Aβ25～35模型鼠记忆障碍的改善作用，并于侧脑室注射后17 d测定各组小鼠脑组织中一氧化氮(NO)含量及一氧化氮合酶(NOS)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)的活性。结果 单侧侧脑室一次注射Aβ25～35 3 μl可引起小鼠学习记忆障碍，同时使脑组织NO含量增加和NOS、iNOS活性升高(P0.01);而大黄酚(0.1，1.0，10.0 mg/kg,ip，17 d)可不同程度改善Aβ25～35造成的学习记忆障碍，并降低脑组织NO含量及NOS、iNOS活性(P0.01)。结论 侧脑室注射Aβ25～35可引起小鼠学习记忆障碍，而大黄酚可能通过抑制iNOS/NO参与的在体条件下对Aβ25～35神经毒性的介导，改善Aβ25～35致小鼠学习记忆障碍。
【关键词】 大黄酚;β淀粉样蛋白;学习记忆;阿尔茨海默病;一氧化氮;一氧化氮合酶。
近年，越来越多的研究发现β淀粉样蛋白(Aβ)在脑内沉积形成老年斑(SP)是阿尔茨海默病(AD)的发病基础〔1〕。以往实验表明大黄酚可抑制大鼠肝、脑过氧化脂质的生成〔2，3〕，对急性衰老小鼠记忆障碍有保护作用〔4〕，但其能否改善Aβ25～35所致的学习记忆障碍，尚未见报道。本研究通过Aβ25～35致小鼠记忆障碍并观察大黄酚的改善作用并探讨可能的作用机制。
1 材料与方法。
1.1 动物 昆明种小鼠,雄性，体重(20±2)g，鼠龄6 w，中国科学院药物研究所动物实验中心提供，(动物批号：SCXK京20040001)。分笼饲养，自由吃食和饮水，室温(20±2)℃。
1.2 药品和试剂 大黄酚(纯度98%)，辽宁生物制药研究所提供，用N，N二甲基甲酰胺溶解，吐温80助溶，生理盐水(NS)稀释成所需浓度;Aβ25～35，购自美国Sigma公司，将1 mg Aβ25～35溶于1 ml无菌生理盐水中，密封后置于37℃培养箱中孵育1 w，使其变为凝聚状态的Aβ25～35〔5〕，—20℃保存。
1.3 主要仪器设备 Morris水迷宫装置，中国医学科学院药物研究所;SBA2程控避暗箱，中国医学科学院药物研究所;721分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;FSH2内切式组织匀浆机，江苏环保仪器厂;802B离心机，上海安亭科学仪器厂;S648型恒温水浴箱，上海医疗器械七厂。
1.4 动物分组和给药 小鼠100只，随机分成5组：对照组，Aβ25～35模型组，大黄酚0.1、1.0、10.0 mg/kg组，每组20天。第1天，对照组侧脑室注射(icv)NS 3 μl，其他各组icv Aβ25～35 3 μl〔6〕。icv后立即ip大黄酚0.1、1.0、10.0 mg/kg，对照组、Aβ25～35模型组ip溶剂10 ml/kg;2～17 d，各小鼠每天ip一次;8～17 d，各小鼠每天ip后60 min开始各项实验。
1.5.1 避暗实验 icv后8 d，将小鼠背向洞口放入明室，同时启动程控避暗箱自动记录装置，记录180 s内小鼠进入暗室的潜伏期和错误次数，以各组小鼠进入暗室的只数与各组小鼠总只数的比值作为各组错误百分率。24 h后以同样方法记录180 s内小鼠错误次数、潜伏期和错误百分率，测验记忆成绩。
1.5.2 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫实验装置由一个不锈钢的圆柱形水池和一个可移动的圆柱形透明有机玻璃站台组成。水池直径120 cm，高50 cm，站台直径12 cm，高24 cm，水深25 cm，水温控制在(23±0.5)℃。水池均等分为4个象限，站台置于第一象限。水池上方的摄像机全程跟踪小鼠的活动，计算机记录小鼠找到站台潜伏期、游泳路径长度和搜索策略。①隐藏平台获得实验〔7〕icv后11～15 d，每只小鼠连续训练5 d，每天4次，每次采用不同的入水点训练120 s。训练时将小鼠面朝池壁轻轻放入水中，同时启动记录装置，小鼠找到站台后，让其停留20 s;若小鼠120 s内未找到站台，则将其放于站台上站立20 s，取下休息120 s后进行下一次训练。记录120 s内小鼠寻找站台的潜伏期、游泳路径长度及所采取的搜索策略。②空间搜索实验〔8〕icv后16 d，将可移动的站台从水池中取出，水深不变。以不同的入水点训练4次。结果以小鼠120 s穿越站台所处位置的次数表示。
1.6 小鼠脑组织NO，NOS和iNOS含量的测定 icv后17 d，将小鼠快速断头取脑，制成10%脑匀浆。取适量上清液按试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明进行NO含量、NOS、iNOS活性测定。
1.7 统计学处理 组间差异显著性用t检验，避暗实验中各组间错误百分率比较用χ2检验。
2 结 果。
2.1 Aβ25～35对小鼠避暗实验的影响及大黄酚的保护作用 结果表明：Aβ25～35可造成记忆障碍，与对照组相比小鼠进入暗室潜伏期缩短(P0.01)，错误次数增加(P0.01)，错误百分率增加(P0.01);而大黄酚(0.1，1.0,10.0 mg/kg)均可不同程度地对抗Aβ25～35所致记忆障碍(表1)。表1 大黄酚对Aβ25～35模型小鼠避暗实验的影响。
2.2 Aβ25～35对小鼠Morris水迷宫实验的影响及大黄酚的保护作用 隐藏平台获得实验结果表明：Aβ25～35造成了小鼠空间学习记忆能力障碍，随着训练天数增加，Aβ25～35模型组与对照组相比潜伏期、游泳路径显著延长;而大黄酚(0.1,1.0,10.0 mg/kg)均可不同程度地改善Aβ25～35所致空间学习记忆障碍。在训练开始时，各组小鼠主要以边缘式和随机式策略寻找站台。随着训练次数逐渐增加，这两种搜索策略的出现率逐渐下降，相反趋向式和直线式搜索策略增加。空间搜索实验结果显示：Aβ25～35模型组与对照组相比穿越平台区域次数减少，有显著性差异(P0.01);而大黄酚(0.1，1.0，10.0 mg/kg)可不同程度地改善Aβ25～35所致空间学习记忆障碍(表2)。表2 大黄酚对Aβ25～35模型小鼠Morris水迷宫实验的影响与对照组比较：1)P0.05，2)P0.01;与模型组比较：3)P0.05，4)P0.01。
2.3 大黄酚对Aβ25～35模型小鼠脑组织NO含量和NOS、iNOS活性的影响 模型组小鼠脑组织NO含量增加，NOS、iNOS活性升高(P0.01);大黄酚(0.1，1.0，10.0 mg/kg)均可降低Aβ25～35模型小鼠脑组织中NO含量及NOS、iNOS活性(P0.01)(表3)。表3 大黄酚对Aβ25～35模型小鼠脑组织NO含量和NOS、iNOS活性的影响与对照组比较：1)P0.01;与模型组比较：2)P0.01。
3 讨 论。
很多学者通过脑内定位注射Aβ片段来制作拟痴呆动物模型并用于药物研究，已取得可喜进展〔9〕。本研究对可溶性Aβ25～35进行了“老化”处理，并利用侧脑室注射Aβ25～35片段成功诱导了小鼠学习记忆障碍模型。
Aβ神经毒性作用的机制说法不一，它可能是通过氧应激、钙超载、胆碱能神经损害、免疫炎症反应等造成记忆障碍。除上述机制外，随着NO及NOS生物学研究的进展，越来越多的证据表明，NO不仅是记忆形成过程中的重要神经递质之一，而且在AD的病理机制中具有重要的作用〔10〕。NO有双相作用，其可参与某些学习过程〔11〕，但NO、NOS的增高也与学习记忆减退密切相关，可能是Aβ神经毒性作用的机制之一〔12〕。本研究显示模型小鼠脑组织NO含量增加，NOS、iNOS活性升高，表明Aβ25～35具有提高iNOS活性作用，可激发机体iNOS/NO表达异常。而大黄酚可降低小鼠脑组织中NO含量及NOS、iNOS活性，提示大黄酚发挥抗Aβ25～35神经毒性的机制可能是通过抑制iNOS与NO介导的毒性实现的。但也有研究认为Aβ的神经毒性与iNOS无明显关系，而主要与nNOS 高表达有关〔13〕。由此可见，目前关于NO、NOS在Aβ神经毒性机制中的作用尚存争议，这除与研究对象体内许多因素，如某些细胞因子、超氧化物歧化酶有关外，还可能与实验条件、方法差异有关。另有观点认为NOS的表达和活性变化是决定NO双重作用的关键〔14〕。
本研究通过避暗实验、Morris水迷宫实验从行为学角度观察到大黄酚(0.1、1.0、10.0 mg/kg)可不同程度改善由Aβ25～35所致的学习记忆障碍。作者已往实验研究表明，大黄酚可抑制脑乙酰胆碱酯酶(AChE)活性〔15〕，清除氧自由基〔5〕，具有抗衰老作用;从Aβ的毒性机制可以推断，大黄酚能够改善Aβ25～35模型小鼠的记忆障碍，除其抑制iNOS/NO介导Aβ25～35神经毒性之外，可能也与该药抑制脑AChE活性，清除氧自由基有关。而防止Aβ沉积，减少其神经毒性作用是预防和治疗AD的重要环节。因此，大黄酚有可能成为治疗AD的新型药物。
【参考文献】 1 Christopher J,Jacqueline P,Jo Anne M,et al.Aβ peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer′s disease〔J〕.Nature,2000;408(6815):97982. 2 张丹参，张 力.大黄酚对大鼠肝过氧化脂质含量的影响〔J〕.张家口医学院学报,1999;16(1):12. 3 王 树,薛贵平,张丹参.大黄酚对大鼠脑过氧化脂质含量的影响〔J〕.张家口医学院学报,2000;17(3):4. 4 Shen LX,Li SJ，Zhang DS,et al.Effects of chrysophanol on memory impairment mice and its mechanism analysis〔J〕.Chinese Pharmacological Bulletin,2003;19(8):9068. 5 Yang SF,Yang ZQ,Zhou OX,et al.Effect of ecdysterone on the expression of cfos in the brain of rats induced by microinjection fAP25～35 into the hippocampus〔J〕.Acta Pharmaceutica Sinica,2004;39 (4):2414. 6 Maurice T,Lockhart BP,Privat A.Amnesia incuced in mice by centrally administered βamyloid peptides involves cholinergic dysfunction〔J〕. Brain Res,1996;706(2):18193. 7 Zhang DS,Zhang JT.Effect of total ginsenoside on memory impairment induced by βamyloid peptide〔J〕.Chinese Pharmacological Bulletin,2000;16(4):4225. 8 Bi JZ,Cao LJ,Xu SL,et al.Protective effect of soy isoflavone on cognition disorder in Alzheimer′s disease model rats〔J〕.J Shandong Univ (Health sciences)，2005;43(10):9203. 9 Zhang J,Cheng Y,Zhang JT.Protective effect of()clausenamide against neurotoxicity induced by okadaic acid and βamyloid peptide25～35〔J〕. Acta Pharmaceutica Sinica，2007;42(9):93542. 10 Nie YH,Wang LN,Ye L,et al.The study of the production of nities oxide in βAmyloid42 stimulated microglia in vitro〔J〕.Acad J PLA Postgrad Med Sch,2005;26:4613. 11 Xu GL,Huang YG,Zhou GQ,et al.Effects of Narginine and nitroprusside on learning and memory in rats〔J〕.J Apoplexy Nervous Dis,2004;21(4):3479. 12 Ye J,Liu XH,Deng H.Betaamyloid for the levels of nitric oxide in nervous tissue and antagonistic role of melatonon〔J〕.J Clin Rehabil，2004;8(34):77123. 13 Simic G,Lucassen PJ，Krsnik Z,et al.nNOS expression in reactive astrocytes correlates with increased cell death related DNA damage in the hippocampus and entorhinal cortex in Alzheimer ′s diseased〔J〕.Exp Neurol,2000;165(1)：1226. 14 刘 辉.Alzheimer病与NO/NOS〔J〕.国外医学·神经病学及神经外科学分册,1999;26(2):757. 15 Zhang DS,Zhang L,Xue GP,et al.Study on antisenility effect of chrysophanol 〔J〕.Chin Hosp Pharm J,2005;25(1):157.