白藜芦醇抑制人脑胶质瘤细胞生长及诱导凋亡比较

作者：常洪波,章翔,甄海宁,费舟,曹卫东。

【摘要】 目的 探讨白藜芦醇（Resveratrol，Res）体外抑制U251、U87和SHG44脑胶质瘤细胞生长及诱导凋亡的不同作用比较，验证Res确可导致U251细胞凋亡。方法 MTT比色法测量不同剂量的Res作用U251、U87和SHG44胶质瘤细胞24h后对增殖的影响及不同剂量的Res作用U251、U87和SHG44细胞6h、24h、48h后的影响。流式细胞仪用Annexin VFITC和PI双染检测U251、U87和SHG44细胞凋亡率。HE染色、Hoechst 33342荧光染色、透射电镜(TEM)观察U251细胞形态改变，流式细胞仪测定U251细胞的细胞周期改变。结果 Res明显抑制U251、U87和SHG44细胞的生长和增殖（P＜0.01）且对U87细胞的抑制作用最强，U251和SHG44细胞次之；对U251细胞的抑制作用呈浓度及时间依赖性反应；Res所致的U251 、U87和SHG44胶质瘤细胞凋亡为浓度依赖关系，且对U87细胞的凋亡作用强于U251和SHG44细胞。U251凋亡细胞的细胞周期主要发生G1期阻滞。结论 Res对U251、U87和SHG44细胞生长抑制及凋亡作用以U87细胞更明显，对U251细胞的抑制作用呈浓度及时间依赖性反应并引起了其细胞周期改变。

【关键词】 白藜芦醇；胶质细胞瘤；细胞凋亡。

Comparison Study on Resveratrol Suppressing Human Glioma Cells Growth and Inducing Apoptosis。

Key words：Resveratrol； Glioma； Apoptosis。

0 引言。

Res是一种多酚类化合物，化学名为3，5，4’三羟基反均二苯代乙烯(3，5，4’trihydroxystilbene, C14H12O3)，分子量228.2 [1]。近年来对其抗肿瘤作用研究较广泛。本研究旨在证明Res可抑制人源脑胶质瘤细胞系U251生长并导致其发生凋亡及细胞周期改变，探讨生长抑制与剂量、时间及凋亡与剂量的关系，并与Res抑制U87及SHG44脑胶质瘤细胞生长及诱导凋亡的作用比较。

1 材料与方法。

1.1 材料。

Res购自Sigma公司，用DMSO溶解配成200 mmol/L贮存液—20℃冻存备用；U251、U87和SHG44细胞系由本研究所提供；DMEM培养基购自Gibico公司；胎牛血清购自灏洋生物公司；MTT、Hoechst 33342荧光试剂盒、Annexin VFITC和PI均为Sigma公司产品。

1.2 方法。

1.2.1 细胞培养。

U251、U87和SHG44细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、5% CO2孵箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 MTT法。

实验首先进行3种细胞Res处理24h的生长状态比较，取对数生长期U251、U87和SHG44细胞，接种至96孔板内；实验按3种细胞分3组，每组将Res分7个不同浓度梯度，分别为5、25、50、100、200、300、400μmol／L的处理组及浓度为0μmol／L Res 的等量DMSO的对照组，每种浓度设6个重复孔，并以空白孔调零。各组细胞培养24h后，将培养液换成含不同浓度Res的培养液，继续培养24h，随后每孔加入20μl、5g/L的MTT，继续培养4h，最后每孔加150μl DMSO振荡10min，酶标分析仪检测490nm波长的光密度值(Optical density，OD)。其次按照同样方法进行Res处理U251、U87和SHG44细胞6h、24h、48h的分组及其细胞生长状态的MTT法OD值测量。所得数据用SPSS 10.0软件计算均数及标准差，并进行方差分析，组间差异采用Dunnettt 检验。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期及Annexin VFITC 和 PI双染检测细胞凋亡率。

消化收集200μmol/L Res处理24h的U251细胞及对照组细胞，调整细胞浓度1×106 /ml各取4ml，按常规细胞周期样品检测方法作程序性处理后进行流式细胞仪检测；分别消化收集300、150、50、5μmol/L Res处理24h组的U251、U87和SHG44细胞和DMSO对照组的细胞，加入5μl Annexin VFITC和5μl PI于细胞悬液中避光染色10min，流式细胞仪检测凋亡的百分比，数据用multicycle分析软件处理。

1.2.4 凋亡细胞的光镜观察。

将U251传代细胞接种于盖玻片表面，培养24h后，换成含200μmol/L Res的DMEM培养液，继续培养24h后，HE染色，光镜观察。

1.2.5 凋亡细胞的Hoechst 33342荧光检测。

200μmol/L Res处理24h的U251细胞按荧光染色试剂盒方法逐步进行后荧光显微镜下摄片。

1.2.6 凋亡细胞的TEM观察。

消化收集200μmol/L Res处理24h的U251细胞，细胞计数1×106 ～107，1 500r/min离心15min后，4%戊二醛固定，按常规TEM样品作程序性处理，行TEM观察。

1.3 统计学分析。

采用SPSS10.0统计软件进行分析，计量资料结果采用(±s)表示，组间均数的比较用t 检验分析和方差分析。