白芍总苷和当归提取物对离体肝细胞凋亡的保护作用
作者：陈象青 谢军 方焱 张善堂 刘圣。
【摘要】 目的观察白芍总苷和当归提取物合用对离体肝细胞凋亡的保护作用。方法采用甲醛诱导小鼠离体肝细胞凋亡。 结果白芍总苷和当归提取物合用可抑制小鼠肝细胞凋亡。 结论白芍总苷和当归提取物合用对小鼠离体肝细胞凋亡有一定的保护作用。
Abstract:ObjectiveTo study the protective effects of total glucosides of Paeony and extract from Angelica sinensis on hepatocyte apoptosis. MethodsHepatocyte apoptosis of mice was induced by Hcho.ResultsTGP and EAS could inhibit hepatocyte apoptosis of mice in vitro.ConclusionTGP and EAs have a protective effect on the hepatocyte apoptosis.
Key words:Total glucosides of paeony； Extract from Angelica sinensis； Hcho； Apoptosis 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）引起的一种严重的世界范围内危害人类健康的疾病，HBV持续感染会导致肝硬化和原发性肝细胞肝癌等肝脏疾病，死亡率很高。WTO已把乙肝列为世界第九死因，寻找安全有效的抗HBV药物已成为当今医药学界一项迫切任务。由于中药治疗能有效地改善症状体征，副作用少，医疗费用较低，使用方便，因而是目前治疗乙肝患者及无症状病毒携带者的主要方法之一。有研究表明，病毒性肝炎的发病机制与肝细胞凋亡密切相关［1，2］，目前认为,病毒感染后,产生肝细胞凋亡的机制可能有以下几个方面:①CTL可通过Fas/FasL及穿孔素/端粒酶B途径引起肝细胞凋亡。暴发性肝衰竭早期, CTL的这种作用,使肝细胞大量凋亡,继而出现肝细胞坏死,肝功能衰竭。②亚急性和慢性重型肝炎时,一些肝细胞增殖抑制因子分泌升高,如TGFβ、TNF—α等对增殖的肝细胞也有很强的诱导凋亡作用,肝细胞的大量凋亡可能是肝再生不良的重要原因之一。③实验性暴发性肝衰竭中,乙肝病毒抗原特异性CTL同乙肝病毒转基因小鼠肝细胞作用,可引起大量肝细胞迅速凋亡。因此，本人拟通过对小鼠离体肝细胞凋亡保护作用的研究，寻找安全有效的抗HBV中药。
1 材料与方法。
1.1 药品与试剂 白芍总苷（TGP）由安徽医科大学馈赠；当归提取物（EAS）由大东方药业有限责任公司提取，批号：20040816，每克相当于生药5.9 g，比重为1.30；云芝多糖由南京同仁堂药业有限责任公司馈赠，批号：050124；甲醛由蚌埠生化试剂厂出品，批号：050407；Coulter DNA—Prep Reagents Kit 试剂盒（DNA—Prep LPR固定液、 DNA—Prep stain染料）为法国库尔特公司产品。
1.2 仪器自动平衡微型离心机（北京医用离心机厂）； Coulter—XL/EPICS型流式细胞仪（美国贝克曼公司）。
1.3 动物昆明种小鼠，雄性，4周龄，安徽省医学研究所动物科提供，合格证：皖医实动准字第01号。
1.4 甲醛致小鼠离体肝细胞凋亡模型的制备选用4周龄的昆明系雄性小鼠，脱颈椎处死后，取2 mm×2 mm×1 mm左右小块肝左叶组织，加5 ml NS，在200目滤网上研磨，并不断过滤，吹打成单细胞，4 000 r/min离心5 min，弃去上清液，残液振匀，取10 μl细胞液，加5ml 1%甲醛，2～4℃冷藏15 min，4 000 r/min离心5 min，弃去上清液，残液分别加5 ml NS清洗，离心，去上清液，各管均洗2次，弃去上清液，残液加50 μl DNA—Prep LPR固定液，振荡，加450 μl DNA—Prep stain染料，避光30 min，用流式细胞仪检测［3，4］，并与加5 ml NS组比较。
1.5 TGP+EAS 预防治疗甲醛诱导的肝细胞凋亡用药方案取4周龄的昆明系雄性健康小鼠24只，随机分为4组：①正常对照组，②模型组，③TGP+EAS组，④云芝多糖组，每组6只。③④组每天ig相应药物，容积为0.2 ml/10 g体质量，①②组每天ig给予等容量NS，连续7d，第7天给药前禁食（自由饮水）12 h，给药2 h后，脱颈椎处死动物。各取2 mm×2 mm×1 mm左右小块肝左叶组织，加5 ml NS，在200目滤网上研磨，并不断过滤，吹打成单细胞，4 000 r/min离心5 min，弃去上清液，残液振匀，取10 μl细胞液，①组加5 ml NS，②③④组各加5 ml 1%甲醛，2～4℃冷藏15 min，4000 r/min离心5 min，弃去上清液，残液分别加5 ml NS清洗，离心，去上清液，各管均洗2次，弃去上清液，残液加50 μl DNA—Prep LPR固定液，振荡，加450 μl DNA—Prep stain染料，避光30 min，用流式细胞仪检测。
2 结果。
2.1 对1%甲醛诱导的小鼠肝细胞凋亡的保护作用由于甲醛是作用强烈的凋亡诱导剂，模型组肝细胞凋亡率达到77.1%，由于EAS+TGP和阳性药物（云芝多糖）的保护作用，这两组的肝细胞凋亡率分别为46.8%和48.4%。结果见表1及图1～4。