山梨猕猴桃根提取物抗肿瘤活性研究

作者：林国彪，张雯艳，张凤芬，陈希慧，黄初升，钟振国。

【摘要】 　　目的 从山梨猕猴桃根中筛选抗肿瘤活性成分。方法采用MTT法、细胞集落形成法筛选山梨猕猴桃根提取物的抗肿瘤活性成分。结果山梨猕猴桃根提取物用集落形成法R6，R8对胃癌细胞株SGC7901、白血病细胞株L1210、神经性肿瘤细胞株NG108—15、肝癌细胞株Bele7404的增殖有抑制作用；用MTT法对NG108—15，SGC7901的增殖有抑制作用。山梨猕猴桃根两种提取物（R6，R8）对脾淋巴细胞没有免疫毒性。结论山梨猕猴桃根提物R6，R8有抗肿瘤活性。

【关键词】 山梨猕猴桃根提取物； 抗肿瘤活性成分筛选； 肿瘤细胞株。

Abstract：ObjectiveTo screen the anti—tumor active components extracted from roots of A. rufa Planch. MethodsThe anti—tumor activity of the components extracted from roots of A. rufa Planch was determined by MTT and clone cells assay.ResultsR6,R8 extracted from roots of A. rufa Planch could restrain the cell proliferation in the stomach carcinoma SGC7901, lymphocytic leukemia L1210, mouse neuroblastomax rat gliom hybrid NG108—15, and human hepatocellular carcinoma Bele7404 cell strain by clone cells and restrain the cell SGC7901, NG108—15 cell strain by MTT. 2 kinds of extracts (R6, R8) had no immunity toxicity to the lymphocyte in spleen. ConclusionThe results show that R6,R8 extracted from roots of A. rufa Planch have the anti—tumor activity.

Key words：The active components extracted from Roots of A. rufa Planch; Screening of the anti—tumor activie components； Tumor cell strain。

山梨猕猴桃根为猕猴桃科猕猴桃植物Actinidia rufa Planch ex Miq.的根或根皮，产于广西贫困山区德保、龙胜等县，一直作为民间中草药使用，其根经药理实验证明，具有抗癌活性［1］。本课题组成员张凤芬等［2］对山梨猕猴桃根醇提物及醇提物的正丁醇提取物的体外抗肿瘤活性进行了研究，确定正丁醇提取物有抗肿瘤活性，我们对正丁醇部位用柱层析分离等方法得37种样品，其中31种粗提物已在另一篇文章介绍，本文就其中6种提取物（单体），用集落形成法研究其对白血病细胞株L1210、人胃癌细胞株SGC7901、神经性肿瘤细胞株、人肝癌细胞株Hela7404细胞增殖的抑制作用；用MTT法研究提取物对SGC7901和NG108—15细胞的增殖的抑制作用，并对有抗肿瘤活性的提取物对正常小鼠脾淋巴细胞进行细胞毒实验。现报道如下。

1 器材。

1.1 山梨猕猴桃根提取物为山梨猕猴桃根提取的乙醇浸膏的正丁醇溶解部分通过柱层析分离等方法得6种单体(以下以R1～R13或代试物表示) 。用蒸馏水溶解后无菌过滤备用。

1.2 肿瘤细胞株白血病细胞株L1210、人胃癌细胞株SGC7901、神经肿瘤细胞株NG108 —15 等均购自上海细胞生物研究所细胞库,人肝癌细胞株Hela7404由广西医科大学药理教研室提供。

1.3 试剂MTT(四甲基噻唑蓝) 为德国Sigma公司产品，批号020609；FBS(胚胎牛血清) 为美国Hyclone公司产品，批号0405；RPMI1640和DMEM培养基为美国GIBCO公司产品，批号1120708 和0311；Trypsin(胰蛋白酶)由天津市灏洋生物制品有限责任公司提供，批号200503；DMSO(二甲基亚砜)由天津汇英化学试剂有限公司提供，批号20030526；Wright’s stain(瑞氏色素)购自上海三爱思试剂有限公司，批号20011026；Giemsa’s stain(吉氏染色素)购自上海试剂三厂，批号20000324。ConA(刀豆蛋白A) Sigma(进口分装) 购自广州达新生物技术开发有限公司 批号：0504。LPS(大肠杆菌脂多糖) Sigma(进口分装) 购自广州达新生物技术开发有限公司，批号0406。

1.4 仪器。

CO2 培养箱(Thermo Forma)，美国产，型号381；倒置显微镜(Olympus)，日本产，型号CK40；酶标仪(Biocell)，澳地利产，型号Sunrise。

2 方法［3］。

2.1 MTT 法测定。

在96孔培养板（NUNC）中每孔加入200μl（含有5 000个/ ml肿瘤细胞）10%FBS RPMI1640（NG108用DMEM）培养液，置CO2培养箱中培养24 h后，实验组分别加入样品，对照组则加入等体积溶剂，每组4孔。置CO2培养箱培养5 d后，弃去上清液（L1210离心处理），加入200 μl/孔新鲜配制的含0.2 mg/ml MTT的无血清培养液，37℃继续培养4 h。弃上清液，加入200 μl，振荡混匀后，用酶标仪（波长为570nm，参比波长为450nm）测定OD值。重复4次。计算结果。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率: 　　肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1—实验组平均OD值对照平均OD值）×%。

2.2 集落形成法。

采用SGC 7901，NG 108—15，Bele 7404，L1210四株肿瘤细胞株。其中L1210用半固体软琼脂集落培养法，取35 mm培养皿，4个为一组，实验组分别加入代试物，对照组加入等体积的培养液，进行相应的处理。盖上培养皿盖，置37℃10%CO2培养箱培养7 d，在16×的显微镜下计数直径大于75 μm(50个细胞以上)的集落。其余3种肿瘤细胞株用贴壁法，用10% FBS RPMI1640 培养液配成含500个/ ml 细胞悬液，每皿加2 ml。实验组分别加入代试物，对照组加入等体积的培养液。置37℃10%CO2培养箱培养7 d，弃去培养液，用瑞氏—吉姆萨染色后计数含50个细胞以上的细胞集落数。重复4次。按下式计算集落形成率：