金克对胃癌细胞的抑制作用
【摘要】 目的 拟探讨金克是否能诱导胃癌肿瘤细胞凋亡，金克能否有效用于胃癌患者的治疗。方法 利用MTT法和Sub—G1法分析金克诱导抑制细胞的能力。将不同浓度的金克与胃癌细胞孵育，在不同的时间点收获，探求金克诱导胃癌细胞抑制的最佳作用时间及作用浓度。结果 通过MTT法和Sub—G1法分析结果显示金克对胃癌细胞的抑制作用，浓度为1.5 g/L的金克诱导胃癌细胞36 h后抑制率达到高峰。结论 MTT法和Sub—G1法是两种快捷、有效检测药物作用的方法，金克对于胃癌细胞的抑制作用介于低度敏感和不敏感之间，但其能增强免疫，无明显毒副作用，具有极大的临床应用前景。
【关键词】 金克；胃癌细胞；抑制作用；Sub—G1；MTT法。
［Abstract］ Objective To study the ability of Jinke to induce the gastric cancer cells（MKN—28） apoptosis，and whethere Jinke may be used in gastric cancer patients’chemotherapy.Methods The ability of Jinke to inhibit cells was detected by the MTT method，the inhibitation ratio reached its top apex，then we detected the apoptosis rate induced by Jinke with the Sub—G1 method.Results When MKN—28 cells were induced by 1.5 g/L Jinke，for 36 h，with the MTT method，the inhibitation ratio reached its top apex，apoptosis rate deteceted by Sub—G1 method reached to the top apex.Conclusion Jinke could induce gastric cancer cells apoptosis，though the chemotherapy sensltivity is not high，without side effect，Jinke may enhance patients’ immune ability and increase living ratio of late phase cancer patients，so its clinical use is very important.
［Key words］ Jinke;gastric cancer cell;inhitation;Sub—G1;MTT method。
槐耳清膏作为一种重要的抗癌中药，目前已有其成品（金克槐耳颗粒，国家一类新药）运用于临床，对肝癌、肺癌、食管癌、胃癌等均有独特疗效。已有实验表明槐耳清膏能诱导人肺腺癌细胞Ａ549凋亡。但其诱导细胞凋亡的机制仍不清楚。本实验拟探讨金克是否能诱导胃癌肿瘤细胞凋亡，通过MTT法，Sub — G1分析金克诱导抑制细胞的能力，以阐明其在胃癌化疗中的药用价值。
1 材料与方法。
1.1 药物与试剂 金克（槐耳清膏）由江苏盖天力药业有限公司提供，碘化丙啶（PI），核糖核酸酶（RNase A），FITC标记的膜联蛋白（FITC—Annexin—V），PRMI—1640培养基，以上均为Sigma公司产品，MTT（晶美生物），小牛血清（Gibco公司），0.25%胰酶，0.04 mol/L酸化异丙醇。
1.3 仪器和器材 FAC—Sort流式细胞仪（美国B.D公司），台式高速离心机，恒温水浴箱，低温冰箱，高压灭菌锅，磁力振荡器，微量加样器，恒温CO2培养箱，超净工作台，高温烤箱，超低温冰箱，超滤除菌器（美国Gelman公司），移液器10 μl、5~40μl、50~200 μl、1 000 μl各一个，96孔、24孔培养板若干，酶联免疫测定仪（BIO—RAD），孔板离心机（SIGMA—4K15），倒置显微镜。
1.4 实验方法。
1.4.1 药品制备 精确称取槐耳清膏1 000 mg（由江苏盖天力药业有限公司提供），将其溶解于10 ml PRMI—1640培养基，以0.22 μm超滤除菌器（美国Gelman公司）过滤除菌，制备成10 mg/ml的PRMI—1640浓缩含药培养液，实验时稀释成不同浓度备用。
1.4.2 细胞培养和处理 （1） 细胞培养：胃癌细胞株MKN—28用常规方法培养：胃癌细胞株MKN—28购自武汉大学。培养条件：加1%青霉素、1%链霉素、10%小牛血清的PRMI—1640培养液，相对湿度94%，5% CO2，37 ℃，细胞浓度为2×105/ml传代。（2） 细胞处理：胃癌细胞株用常规方法培养，取对数生长期细胞进行实验。将细胞分为对照组、不同浓度金克（0.75 g/L，1.5 g/L，3.0 g/L）诱导组，共同培养12 h后，每6 h收集细胞，然后将每组细胞分3份，分别用于MTT法、Sub—G1法检测。
1.4.3 MTT法检测金克对胃癌MKN—28的抑制作用 将对数生长期胃癌细胞用0.25%胰酶消化，用灭菌PBS稀释离心去上清，用培养基重悬细胞计数，调整细胞浓度为106/ml，将细胞按每孔90 μl种板，将细胞分为对照组、不同浓度金克（0.75 g/L，1.5 g/L，3.0 g/L）诱导组，每孔设两复孔，按6 h，12 h，18 h，24 h，30 h，36 h，42 h，48 h设计分别种板，分别在6 h，12 h，18 h，24 h，30 h，36 h，42 h，48 h收获，用孔板离心机离心去上清，0.25%胰酶消化，每孔加90 μl培养基重悬细胞，每孔加MTT 10 μl，并增设阴性对照，37 ℃孵育4 h，每孔加入0.04 mol/L酸化异丙醇100 μl，用吸管反复吹打使接近结晶颗粒溶解后，用免疫酶标仪在570 nm波长测光密度值（OD值）。
1.4.4 Sub—G1法检测金克诱导胃癌MKN—28细胞的凋亡 将对数生长期细胞分为对照组、不同浓度（0.75 g/L，1.5 g/L，3.0 g/ L） 金克诱导组，共同培养18 h 后，每6 h 收集细胞，然后将每组细胞分两份，分别用Sub—G1 法检测。将收获新鲜细胞用PBS 洗涤一次，80 %的冰乙醇固定过夜，PBS 洗涤一次，加100 μl 浓度为10 mg/L的PI和5 0 μl 浓度为0.1%的RNase A，室温下避光放置20 min，用流式细胞术检测。经上述处理的细胞，荧光标记成功后，应用FAC Sort流式细胞仪检测。经488 nm激光激发，被标记细胞发射的红色（PI）被FAC Sort流式细胞仪的标准透镜接受。应用Cellquest软件（B．D．公司，美国），对上述所测细胞的单参数荧光强度、任一细胞群体的平均荧光强度进行分析。
1.4.5 结果的判断 MTT法取三个复孔光密度值（OD）的平均值作为细胞在此药组的平均光密度值（OD）。按公式计算肿瘤细胞的抑制率：
抑制率=对照组OD值—用药组OD值 对照组OD值—空白组OD值×100%。
被（PI）标记细胞经488 nm激光激发发射的红色荧光被FAC Sort流式细胞仪的标准透镜接受。应用Cellquest软件（B．D．公司，美国），对上述所测细胞的单参数荧光强度、任一细胞群体的平均荧光强度进行分析。