异丙酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响
【摘要】 目的： 研究异丙酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中细胞凋亡的影响. 方法： SD大鼠60只，体质量290~310 g,随机分为假手术组、异丙酚组和对照组，每组20只. 用改良Longa法制成鼠脑缺血/再灌注模型（缺血2 h，再灌2 h）,光镜下观察细胞形态学变化，TUNEL法观察细胞凋亡变化. 结果： 光镜检查异丙酚组细胞肿胀坏死明显减轻，凋亡细胞及坏死细胞明显减少. 再灌2 h后对照组凋亡细胞比率、凋亡细胞阳性率、TUNEL阳性率均较假手术组高(P0.01)，异丙酚组凋亡细胞阳性率、TUNEL阳性率较对照组减少（P0.05）. 结论： 异丙酚能减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，具有抑制神经细胞凋亡坏死的作用.
0引言 异丙酚能降低脑血流量、脑耗氧量和颅内压,是临床上脑损伤外科手术麻醉以及脑中风患者躁动镇静的常用药物之一. 研究证实,麻醉剂量异丙酚对实验性大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用［1］,也有实验发现,镇静剂量异丙酚能明显改善大鼠脑缺血的形态学变化［2］ . 其作用机制是多途径、多位点的，包括直接清除自由基、抑制脂质过氧化作用、还原高氧化铁蛋白、调节钙离子平衡等，还有抑制缺血部位兴奋性氨基酸的释放. 但对缺血再灌注后的细胞凋亡机制报道较少. 本实验旨在探索异丙酚对大鼠缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响.
1材料和方法。
1.1材料健康雄性SD大鼠60只，体质量290~310 g（西安交通大学医学院动物实验中心提供），随机分为3组： 异丙酚组、对照组、假手术组，每组20只. 用改良Longa法［3］：大鼠腹腔注射100 mL/L水合氯醛300 mg/kg麻醉,颈部正中切口,分离左颈总动脉及其分叉处, 凝断颈外动脉(ECA)的3个主要分支,游离ECA,两端结扎,靠近远心端将其剪断,取40尼龙线尖端靠近热源烫钝呈鼓锤状置入ECA,用丝线扎紧,将尼龙线由ECA插入颈内动脉(ICA),深度为17~22 mm. 此时大脑中动脉(MCA)起始处被阻断,同时也阻断了来自ICA,ACA,PCA的侧副血流,导致MC区局部缺血，完成局灶脑缺血步骤. 脑缺血成功的标志为动物苏醒后出现同侧的Horner征和对侧以前肢为重的偏瘫. 缺血2 h后拨出尼龙线恢复MCA血流,完成再灌注步骤. 手术过程观察呼吸节律,用加热灯保持大鼠肛温(37±0.5)℃. 假手术组仅将尼龙线放入ECA,其他操作相同. 异丙酚组于缺血前10 min腹腔注入异丙酚100 mg/kg（英国阿斯利康公司提供）. 对照组于缺血前腹腔注入等容积生理盐水. 再灌注2 h后，开颅取脑，置入40 g/L甲醛溶液中固定.
1.2方法。
1.2.1细胞光镜观察灌注后2 h后，断头取脑，以视交叉前后两点冠状切片，片厚约4 mm，将脑片放入40 g/L甲醛溶液中固定.常规梯度脱水、透明、包埋、浸蜡、切片厚6 μm. HE染色，切片常规脱蜡至水，苏木精染色5 min，盐酸乙醇分色30 s，伊红复染1~2 min，水洗、脱水、透明、中性树胶封片，观察组织学变化.
1.2.2细胞凋亡检测（TUNEL法）原位末端标记细胞凋亡试剂盒由德国Boehringer Mannheim公司提供. 切片常规脱蜡至水，按试剂盒说明书操作，DAB显色2~5 min，苏木素复染、封片. 于光镜下观察，TUNEL染色阳性并伴有核染色质浓聚、核染色质靠边凝集或凋亡小体形成者为凋亡细胞；TUNEL染色阳性但呈弥漫着色为坏死细胞；TUNEL染色阴性为正常细胞. 光镜下随机选取每张切片梗死周边组织五个视野，分别计数每1000个细胞中TUNEL阳性、凋亡细胞、坏死细胞数，计算TUNEL阳性细胞的百分率. TUNEL阳性细胞百分率=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%. 凋亡细胞阳性率=凋亡细胞/（TUNEL阳性细胞+TUNEL阴性细胞），凋亡细胞比率=凋亡细胞/（凋亡细胞+坏死细胞）×100%. 统计学处理： 数据以x±s表示，应用SPSS13.0统计软件，采用非参数秩和检验分析组间差异. P0.05有统计学差异.
2结果。
2.1形态学改变HE染色下，对照组相当于缺血中心区的顶叶、颞叶区神经细胞染色淡，出现细胞肿胀，细胞核碎裂、溶解等细胞坏死特征（图1A）. 相当于缺血半暗带的额叶皮质等区神经细胞数量减少、体积缩小，部分胞浆成嗜酸性改变，细胞间隙增宽，细胞核固缩，染色质浓缩，边聚. 假手术组切片未出现上述变化. 异丙酚组部分皮质部神经元结构完整，坏死细胞和凋亡细胞减少（图1B）.
A：对照组； B：异丙酚组. 图1神经细胞凋亡TUNEL ×400（略）。
2.2细胞凋亡对照组皮质和纹状体都可见大量凋亡细胞，核固缩、碎裂较多. 假手术组未见凋亡细胞. 异丙酚组部分细胞核固缩、可见核碎裂，部分细胞可见核仁，与对照组相比，凋亡细胞减少（P0.05，表1）.