丝裂霉素对人胃癌细胞超微结构和拓朴异构酶表达的影响

作者：白金君 蒋亚楠 孙黎 薄爱华。

【摘要】 目的：探讨丝裂霉素对胃癌细胞拓朴异构酶Ⅱα（TOPOⅡα）表达的影响。方法：人胃癌细胞株BGC823培养，加入丝裂霉素后5h和10h后采集细胞，进行光、电镜观察和免疫组化染色。结果：5h组形态变化不明显，胞核中TOPOⅡα含量减少；10h组，细胞器减少，质膜破裂，其胞质与胞核中TOPOⅡα表达明显减少。结论：丝裂霉素对BGC823癌细胞有明显的杀伤作用，其途径之一可能与抑制TOPOⅡα基因表达有关。

【关键词】 丝裂霉素 胃肿瘤 免疫组织化学。

【ABSTRACT】 Objective:To study the killing function of mitomycin(MMC) to gastric cancer cells and the expression of TopoⅡα.Methods:Human gastric cancer cellsBGC823 was cultured,while MMC was added to culture continuously for 5 h or 10 h.Then the gastric cancer cells were observed under optical microscope and transmission electron microscope and stained with immunohistochemical method as well.Results:The morphology of gastric cancer cell was not changed significantly,but content of TopoⅡαin nuclear was reduced in the group for 5 hours.The changes in the group for 10 hours were as follows:the cell organ was obviously destroyed,the cell merabrane were burst,and the expression of TOPOⅡα was reduced significantly in cytoplasm and nuclear.Conclusion:Mitomyclin has killing fuction to gastric cancer cells,one of ways was to restrain the expression of TOPOⅡα gene.

【KEY WORDS】 Mitomycin,Stomach Neoplasms,Immunohistochemistry。

丝裂霉素(Mitomycin,MMC)是一种广谱抗肿瘤药物，用来治疗胃肠道恶性癌瘤、乳腺癌及肝癌等，其作用效果和用药方法临床已有报告[1]，而对其作用途径，尤其是它对重要酶系的影响，尚未见报告。本实验采用细胞培养技术,光、电镜观察方法和免疫组织化学技术，观察丝裂霉素对人源性胃癌细胞株(BGC823)拓朴异构酶（TOPOⅡα）的影响，为探讨丝裂霉素的抗癌机制提供科学依据。

1 材料和方法。

1.1 材料 丝裂霉素注射液（Mitomycin of injection ）由浙江省海正药业股份有限公司生产；BGC823胃癌细胞株由北京肿瘤研究所提供；二氧化碳培养箱和RPMI1640培养液由河北北方学院实验中心提供。

1.2 方法 将5×104浓度的BCG823细胞接种于无菌6孔板中培养。在部分6孔板中加入无菌盖玻片，使癌细胞附壁生长（爬片）。另有部分6孔培养皿不加盖片，待癌细胞培养4h后，对照组不加入药物，实验组则向培养液中加入MMC 15μL(0.0075mg),继续培养爬片。分别加药后5h、10h后取出盖片，用4%多聚甲醛固定，常规洗涤和SP免疫组织化学染色。兔抗人TOPOⅡα血清由博士德公司购入，SP试剂盒及DAB显色剂由北京中杉金桥公司购入。其操作程序按试剂盒说明书进行。阴性对照PBS代替Ⅰ抗，阳性对照为已知人胃癌组织切片。

1.3 超薄切片及电镜观察 将加药后培养液于5h、10h分别离心，2%戊二醛固定。常规1%锇酸后固定，制成Epon812树酯块，超薄切片和铀铅染色，JEM100CXⅡ透射电镜下观察摄像。

1.4 统计学处理 利用彩色图像分析仪软件进行图像分析。每组随机计数100个癌细胞，以灰度值表示着色深浅（深者灰度值低，浅者灰度值高）。借助SPSS软件进行方差分析，然后进行独立样本t检验。

2 结果。

2.1 光、电镜下癌细胞形态变化 HE染色后光镜下可见对照组胃癌细胞呈多边形、梭形、不规则形，加药后5h组癌细胞外形无明显变化，仅表现有长突癌细胞减少；10h组大部分癌细胞破裂或细胞周边呈毛刺状，质膜不清或消失，可见细胞破损。电镜下可见5h组部分细胞肿胀细胞器减少;10h组，线粒体肿胀，嵴消失，细胞膜破裂或出现缺损，内质网扩张、附着核糖体和游离核糖体减少或消失，次级溶酶体增多，提示细胞代谢障碍。

2.2 免疫组化染色 TOPOⅡα阳性物质呈棕黄色或黄色，分布在癌细胞核与质中，因核内含量较多,用药5h组胞核与胞质阳性物质均减少，其灰度升高（表示着色浅），并与对照组有显著性差异（P0.01）（见表1）。10h组生存细胞减少，只有生命力强代谢旺盛的部分细胞仍存活，所以这些细胞核中仍含TOPOⅡα，但是与对照组相比含量减少。部分癌细胞核质界线不明显，在破损细胞周边处有深染物（图1、2、3）。2008年8月白金君等：丝裂霉素对人胃癌细胞超微结构和拓朴异构酶表达的影响表1 TOPOⅡα在BGC823胃癌细胞中表达灰度值。