脑力智宝对实验性脑缺血大鼠学习记忆与神经细胞凋亡的影响
【摘要】 目的研究脑力智宝对实验性脑缺血大鼠学习记忆功能与神经细胞凋亡的影响。方法结扎实验大鼠双侧颈总动脉制作脑缺血模型，Morris水迷宫法测试其学习记忆功能，HE染色法观察其神经细胞形态学改变，TUNEL法检测凋亡细胞。结果脑力智宝能显著缩短实验性脑缺血大鼠的逃避潜伏期，增加跨越原平台位置的次数；显著减少顶叶皮层及海马CA1区凋亡细胞的数量。结论脑力智宝对脑缺血损伤所致学习记忆功能减退具有改善作用，可能与其能减少神经细胞凋亡有关。
Abstract:ObjectiveTo observe the effects of Naolizhibao(NLZB) on learning and memory and neuron apoptosis of cerebral ischemia rats. MethodsCerebral ischemia model in rats was established by ligating the bilateral common carotid arteries. Morris water maze test was applied to determine the learning and memory ability. The brain tissue of rats was taken for morphological observation using HE stain, and TUNEL assay was applied to detect apoptosis cells in brain. ResultsMorris water maze test showed that NLZB obviously shortened the escape latent period, increased the times of traversing flat roof, and reduced the apoptotic cells in cerebral cortex and hippocampal CA1 region. ConclusionNLZB can improve learning and memory of cerebral ischemia rats, and the mechanism might be reducing to reduce apoptotic cells.
Key words:Naolizhibao; Cerebral ischemia; Learning and memory; Apoptosis。
脑力智宝用于治疗精神发育迟滞、脑瘫、脑血管病后遗症、脑外伤后遗症、脑炎后遗症、老年性痴呆等脑病伴发的智力和肢体功能障碍，具有一定的疗效。临床研究表明脑力智宝能明显改善脑梗塞后遗症患者运动、语言及精神方面的症状［1］。离体细胞研究表明脑力智宝及其含药血清可能通过促进Bcl—2蛋白的表达、增加细胞膜流动性等途径对硝普钠诱导的PC12细胞凋亡具有保护作用［2］。本实验观察了脑力智宝对实验性脑缺血损伤大鼠学习记忆功能与神经细胞凋亡的影响，旨在阐明脑力智宝用于治疗脑缺血损伤性疾病后遗症的机理。
1 材料与方法。
1.1 动物 健康Wistar大鼠，体重220～250 g，雌雄各半，广州中医药大学实验动物中心提供。
1.2 药物与试剂 脑力智宝由广东高明脑病医疗医药研究院提供，制备成1 g生药/ml供试液，灌胃前按所需浓度稀释。尼膜同（尼莫地平，nimodipine, Nim）片剂，德国拜耳公司产品，批号CAGFT3。TUNEL法凋亡细胞检测盒，德国宝灵曼公司（BOEHRINGER MANNHEIM）产品。
1.3 脑缺血损伤致学习记忆障碍模型的制备［3］大鼠经10%乌拉坦1 g/kg腹腔注射麻醉后，仰卧位固定，行颈正中切口，分离双侧颈总动脉，用丝线结扎，缝合皮肤。假手术组大鼠同法分离双侧颈总动脉，但不结扎。
1.4 分组与给药 将造模成功动物随机分为4组：模型组、尼莫地平组、脑力智宝小剂量组与脑力智宝大剂量组，每组8只，雌雄各半。假手术组大鼠8只，雌雄各半。待大鼠苏醒后，尼莫地平组按12 mg/kg灌胃给予尼莫地平混悬液；脑力智宝不同剂量组分别按小剂量4 g/kg、大剂量8 g/kg灌胃给予脑力智宝供试液；假手术组和模型组分别给予等容量生理盐水，1次/d，连续30 d。
1.5 Morris水迷宫测试 各组大鼠在药物干预结束后开始水迷宫测试。水迷宫由直径130 cm，高50 cm圆形水池组成，水深30 cm，水温（26±1）℃，在水池壁标明4个入水点，由此将水池分为4个象限，任选一象限，正中放一个直径12 cm，高29 cm的平台，没于水下1 cm，水面覆盖泡沫塑料。测试包括：①定位航行实验：历时6 d，分别从4个不同的标记入水点，将大鼠面向池壁放入水中，记录在120 s内寻找平台所需的时间（逃避潜伏期）。若大鼠入水后120 s内未能找到平台，则将其置于平台上并停留15 s，逃避潜伏期记录为120 s。②空间探索实验：定位航行实验结束后，撤除平台，任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录120 s内跨越原平台位置的次数。
1.6 脑组织形态学观察 将进行学习记忆能力测试后的大鼠麻醉下处死，快速断头取脑，浸泡于10%中性甲醛液中固定。切片进行HE染色，光镜下观察拍片。普通光镜400×倍下计数海马CA1区锥体细胞层500 μm范围内核完整椎体细胞数目与顶叶皮层每个视野下核完整神经细胞数目，每张切片计数5个不重叠视野。
1.7 原位细胞凋亡检测 切片经脱蜡、水洗、蛋白酶K消化、TUNEL反应，按试剂盒指示常规操作。光镜下观察拍片，普通光镜400×下计数海马CA1区锥体细胞层500 μm长范围内凋亡细胞数目与顶叶皮层每高倍视野下凋亡细胞数目，每张切片计数5个不重叠视野。
1.8 统计学处理 实验数据用±s表示，运用统计软件SPSS11.0 for windows 11.5 进行重复测量方差分析与单因素方差分析。
2 结果。
2.1 定位航行实验结果 在定位航行实验中，随着训练次数的增加，各组大鼠的平均逃避潜伏期总体呈逐渐下降趋势，但下降的速率不一致，各组大鼠平均逃避潜伏期的比较见图1。第1，4，5，6天，模型组平均逃避潜伏期较假手术组明显延长（P0.01）。与模型组比较，尼莫地平组第5，6天平均逃避潜伏期明显缩短（P0.01），脑力智宝小剂量组第1，4，5，6天平均逃避潜伏期明显缩短（P0.05或 P0.01），脑力智宝大剂量组第1，2，4，5，6天平均逃避潜伏期明显缩短（P0.01），而与假手术组比较差异无显著性（P0.05）。
2.2 空间探索实验结果 在第7天的空间探索试验中，模型组大鼠多在平台所在的象限外游泳，而其他组大鼠运动轨迹多位于原平台所在象限，各组大鼠跨越原平台位置的次数比较见表1 。与假手术组比较，模型组大鼠跨越原平台位置次数明显减少( P0.01) ；尼莫地平组、脑力智宝小剂量组和大剂量组大鼠跨越原平台位置次数较模型组明显增加(P0.01)。表1 各组大鼠在空间探索试验中跨越原平台位置的次数。
2.3 脑组织形态学观察 模型组大鼠大量神经细胞坏死或严重皱缩，体积变小，胞核与胞浆界限不清，血管、神经元及胶质细胞周围间隙扩大。各给药组大鼠坏死神经细胞显著减少，零星可见一些损伤细胞，海马椎体细胞层细胞形态、排列基本正常。见图2～9。各组大鼠顶叶皮层与海马CA1区核完整神经细胞数量比较结果见表2。与假手术组比较，模型组顶叶皮层与海马CA1区核完整神经细胞数量显著减少（P0.01）；与模型组比较，尼莫地平、脑力智宝小剂量与大剂量均能显著改善不完全脑缺血所导致的神经细胞坏死与丢失（P0.05或P0.01）。